יצירת גנום חיידקי שלם מדגימות קליניות באמצעות זרימת עבודה של העשרת מטרה
15 באוגוסט 2025
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ריצוף גנום שלם של זיהומים חיידקיים המועברים במגע מיני מדגימות קליניות באמצעות העשרת מטרה. שיטה חדשנית זו מבוססת פאנל סינדרומי מתגברת על אתגרים של DNA אנושי בשפע ועומסי חיידקים נמוכים, ומקלה על מעקב גנומי אחר Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ו-Mycoplasma genitalium.
גנומים יכולים לספק מידע על המוצא, ההעברה והיכולות של פתוגן. עבור חיידקים שאינם ניתנים לתרבית, ניתן להשיג מידע זה רק באמצעות העשרת מטרה. ריצוף פתוגנים חיידקיים ישירות מדגימות קליניות הוא מאתגר בגלל הדנ"א האנושי העצום, המיקרוביוטה המגוונת ועומסי החיידקים הנמוכים במיוחד.
במקרים רבים, תרבות אינה אופציה, בשל שיטת הדגימה והחיידקים הקפדניים. תוך כדי יישום טכנולוגיה זו על חיידקים המועברים במגע מיני, גילינו שושלת חדשה של Chlamydia trachomatis LGV הנקראת ompA-genotype L4, ואישרנו התרחבות גלובלית של שושלת LGV הדומיננטית, וסיפקנו תובנות מפתח לאבחון מולקולרי ומעקב אפידמיולוגי. פרוטוקול העשרה זה מאפשר התאוששות מלאה של הגנום מדגימות קליניות חיוביות של מחלות מין.
מצאנו שטכניקה זו עולה על ריצוף עמוק מטגנומי, דלדול DNA מארח וריצוף אדפטיבי של ננו-נקבוביות. אנו חוקרים את הזנים המסתובבים של פתוגנים אלה ברחבי אירופה ובארגנטינה. יש לכך פוטנציאל ליידע לגבי העברה וניהול אנטי-מיקרוביאלי.
כדי להתחיל, מדוד את ריכוז ה-DNA של תמציות ה-DNA מדגימות קליניות בשיטה רגישה ומדויקת מבוססת פלואורסצנטיות. לדלל כל דגימת DNA באמצעות מים נטולי נוקלאז ל-10 עד 200 ננוגרם בנפח סופי של 17 מיקרוליטר בכל רצועת צינור PCR. הוסף 3 מיקרוליטר של תערובת מאסטר פיצול לכל באר המכילה את 17 המיקרוליטרים של DNA מדולל.
פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים כדי לערבב היטב. לאחר מכן, אטום את רצועת צינור ה-PCR. מערבל את הרצועה במהירות גבוהה למשך 10 שניות וסובב קצרות כדי לאסוף את התוכן.
לאחר מכן, הנח את רצועת צינור ה-PCR במחזור התרמי והתחל את הפרוטוקול המתוכנת מראש לפיצול ודגירה. לאחר מכן, הכינו את התיקון הסופי ואת תערובת המאסטר של זנב ה-dA כפי שמוצג בטבלה. מערבולת וסובב את הצינור כפי שהוצג קודם לכן ושמור אותו על קרח.
לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של תיקון הקצה ותערובת מאסטר זנב dA לכל באר המכילה 50 מיקרוליטר של שברי DNA. אטום את הרצועה והמערבולת במהירות גבוהה למשך שמונה שניות. לאחר סיבוב קצר של הרצועה, הכנס אותה בחזרה למחזור התרמי.
לאחר סיום תוכנית המחזור התרמי, הנח את רצועת צינור ה-PCR על קרח. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה בטמפרטורת החדר, שהוכנה 30 עד 45 דקות מראש לכל באר המכילה את שברי ה-DNA. הוסף 5 מיקרוליטר של תערובת אוליגו מתאם לספריות מתויגות NBC לכל באר.
הכנס מיד את רצועת צינור ה-PCR בחזרה לתוך המחזורי התרמי והמשך בתוכנית. כדי להתחיל בטיהור DNA, אחזר את החרוזים המגנטיים מ-4 מעלות צלזיוס ואפשר להם להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר לכל דגימה היטב.
הנח את רצועת צינור ה-PCR על המעמד המגנטי ושטוף כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטר של 70% אתנול. המתן דקה אחת במהלך כל שטיפה והסר בזהירות את האתנול מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים. לאחר ערבוב ודגירה של החרוזים עם 35 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז למשך חמש דקות, שאפו בזהירות את הסופרנטנט המנוקה מכל באר והעבירו אותו לבאר מתאימה ברצועת צינור PCR חדשה.
הנח את רצועת צינור ה-PCR החדשה על קרח והשליך את החרוזים המגנטיים. קח את תערובת תגובת ה-PCR המוכנה לפני הלכידה מחדש והוסף 11 מיקרוליטר ממנה לכל דגימה המכילה את ספריית ה-DNA המטוהר. הוסף 5 מיקרוליטר של תיקון האינדקס הראשוני שנבחר לכל תגובה ואטום את רצועת צינור ה-PCR.
התחל את תוכנית המחזור התרמי להגברת PCR כמפורט בטבלה כדי לבצע את ה-PCR לפני הלכידה. הוסף את רצועת צינור ה-PCR רק לאחר שהמחזור התרמי הגיע ל-98 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת ה-PCR לפני הלכידה, בצע ניקוי נוסף מבוסס חרוזים כדי לטהר את הספרייה.
דגרו את מוצר ה-PCR בעזרת חרוזים מגנטיים. לאחר מכן, הנח את צינור רצועת ה-PCR על מכשיר הפרדה מגנטי והמתן 5 עד 10 דקות עד שהתמיסה תתבהר. בזמן שהרצועה נשארת על המעמד המגנטי, הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט השקוף מכל באר.
לאחר מכן, הוציא את ה-DNA ב-15 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז ומדוד את ריכוז ה-DNA של ספריית ה-DNA המטוהר. עבור הכלאה לדוגמה, תכנת את המחזור התרמי על פי הפרוטוקול המצוין כאן. הפעל את התוכנית והשהה מיד את הריצה.
מדללים 500 עד 1,000 ננוגרם מספריות ה-DNA המוכנות לנפח סופי של 12 מיקרוליטר באמצעות מים נטולי נוקלאז. לאחר מערבולת וסיבוב תערובת חוסם האוליגונוקלאוטיד, הוסף 5 מיקרוליטר לכל צינור דגימה. אטום את רצועת צינור ה-PCR והנח אותה במחזור התרמי.
השהה את המחזור התרמי כאשר הוא מגיע לשלב השלישי של הפרוטוקול. הוסף 13 מיקרוליטר מתערובת הכלאת הבדיקה המוכנה בטמפרטורת החדר לכל דגימה תוך שמירה על הרצועה בתוך המחזור התרמי. פיפטה לאט למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים לערבוב.
ודא שאין בועות אוויר, והנח את הרצועה בחזרה לתוך המחזור התרמי. לאחר מכן, ודא שכל הצינורות אטומים היטב. כדי ללכוד את הספרייה ההיברידית, העבירו את כל הנפח מכל צינור לצינורות המתאימים המכילים 200 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין שטופים מראש.
אוספים את חרוזי הסטרפטווידין לפני שטיפתם עם מאגר כביסה בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת רצועת צינור ה-PCR מהמפריד המגנטי, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה בטמפרטורה גבוהה שחומם מראש ל-70 מעלות צלזיוס והשעיה מחדש של החרוזים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. אטום את רצועת הצינור, מערבולת במהירות גבוהה וסובב במהירות כפי שהודגם קודם לכן.
הנח את רצועת הצינור האטום בבלוק המחזור התרמי בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס ודגר למשך 5 דקות. העבר את רצועת צינור ה-PCR מהמחזור התרמי בחזרה למפריד המגנטי בטמפרטורת החדר. המתן דקה אחת עד שהפתרון יתבהר.
לאחר מכן, הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לכל צינור שמכיל את החרוזים. תכנת את המחזור התרמי כמפורט בטבלה המוצגת כאן.
הוסף 25 מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR המוכנה לאחר הלכידה לכל צינור דגימה. מערבבים את התגובה עד שהמתלה אחיד, ואטומים היטב את רצועת צינור ה-PCR מבלי לסובב אותה כלפי מטה. הנח את רצועת צינור ה-PCR האטומה במחזור התרמי.
לאחר העברת מוצר ה-PCR לצינור טרי, הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים לכל צינור דגימה ובצע את ניקוי ה-DNA כפי שהוצג קודם לכן. למדוד את ריכוז ה-DNA של ה-DNA המטוהר הסופי באמצעות שיטת כימות מבוססת פלואורסצנטיות. העשרת המטרה הביאה לאחוזים גבוהים משמעותית של קריאות על המטרה, ולכן גנומים שלמים בהשוואה לריצוף ישיר על פני כל הפתוגנים שנבדקו, כולל Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ו-Mycoplasma Genitalium.
הצלחת ריצוף הגנום נצפתה בעיקר בדגימות עם ערכי סף מחזור qPCR מתחת ל-30 עבור כל ארבעת הפתוגנים. עם מתאם הפוך ברור בין ערכי CT לאחוז הקריאות על המטרה עבור כלמידיה טרכומטיס. באמצעות טמפרטורת הכלאה של 62.5 מעלות צלזיוס בהשוואה ל-65 מעלות צלזיוס הקודמות, שיפר את כיסוי הגנום של מיקופלזמה גניטליום מבלי להפחית את הביצועים עבור פתוגנים המטרה האחרים.
ניתוח פילוגנטי של גנומים של כלמידיה טרכומטיס מארגנטינה הראה דגימות רבות שהתקבצו בתוך קבוצת L2b וחשף שושלת חדשה שהוצעה כגנוטיפ L4 של ompA המופרד מכל הגנומים הקודמים של LGV על ידי כ-600 פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול לרצף גנום שלם של זיהומים מין חיידקיים מדגימות קליניות באמצעות העשרת מטרה. השיטה מתמודדת עם האתגרים שמציבים DNA אנושי בשפע ועומסים חיידקיים נמוכים, ומאפשרת מעקב גנומי של פתוגנים מרכזיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- גנומיקה
- מחלות זיהומיות
רקע
- גנומים מספקים תובנות לגבי מוצא הפתוגנים, העברתם ויכולותיהם.
- העשרת מטרה חיונית לחיידקים שאינם ניתנים לגידול.
- רצף ישיר מדגימות קליניות מסובך על ידי DNA אנושי ועומסים חיידקיים נמוכים.
- שיטות גידול עשויות שלא להיות קיימא לחיידקים תובעניים.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לרצף זיהומים מין חיידקיים ישירות מדגימות קליניות.
- לשפר אבחון מולקולרי ומעקב אפידמיולוגי.
- לחקור זנים מסתובבים של פתוגנים באזורים שונים.
שיטות ששימשו
- מדידת ריכוז ה-DNA בשיטות מבוססות פלואורסצנציה.
- פרגמנטציה ותיקון קצוות של דגימות DNA.
- הגברה ב-PCR והכלאה של ספריות DNA.
- ניקוי מבוסס חרוזים לטיהור הספרייה.
תוצאות עיקריות
- גילוי שושלת חדשה של Chlamydia trachomatis LGV.
- אימות התרחבות גלובלית של שושלת ה-LGV הדומיננטית.
- הפרוטוקול מתעל על רצף עמוק מטאגנומי ושיטות אחרות.
- פוטנציאל להעיד על דינמיקת העברה וטיפול אנטי-מיקרוביאלי.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מאפשר התאוששות גנום מלאה מזיהומי מין.
- הוא מספק תובנות קריטיות למעקב בריאות הציבור.
- חקירות עתידיות יתמקדו במחזור זנים באירופה וארגנטינה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ריצוף ישיר של הגנום השלם של מחלות מין עובריות (STIs) חיידקיות מדגימות קליניות נותן מענה לבקבוק קריטי בגנומיקה של מחלות זיהומיות, תוך התגברות על אתגרים הנובעים מעומס נמוך של פתוגנים ומרקע גבוה של DNA אנושי. תהליך העשרה של מטרות זה מאפשר מעקב גנומי חסון, ניטור של עמידות לאנטיביוטיקה וגילוי שושלות עבור פתוגנים דורשנים שאינם ניתנים לתרבית. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי ואת קבלת ההחלטות לגבי פורטפוליו במיקרוביולוגיה תרגומית ובמו"פ של מחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר אפיון גנומי מקיף של פתוגנים חיידקיים שאינם ניתנים לתרבית, ישירות מחומר קליני.
- תומך בזיהוי של שושלות חדשות וגורמי עמידות, ובכך מסייע בתעדוף מטרות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים על ידי הבהרת הגיוון של הפתוגנים ודינמיקת ההעברה שלהם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק נתונים גנומיים שעברו תיקוף לצורך תכנון בדיקות ופיתוח אבחנה מולקולרית.
- משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות על ידי העשרה של DNA של פתוגנים ביחס לרקע של המאכסן.
- מאפשר תהליכי עבודה ניתנים להרחבה עבור מעקב וסריקה של פתוגנים בתפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין פלטים גנומיים לבין גילוי סמנים ביולוגיים תרגומיים לצורך ניטור עמידות לאנטיביוטיקה.
- תומך ברציפות החל מניתוח דגימות קליניות ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים למחקר מחלות זיהומיות.
- מפחית את הסיכונים בקבלת החלטות לגבי קידום שלבים על ידי אספקת תובנות גנומיות יישומיות למעקב אפידמיולוגי.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול העשרת המטרה זה משתלב ברצף הגילוי של מחלות זיהומיות, ומגשר בין ניתוח דגימות קליניות, מעקב גנומי ומחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על גיוון פתוגנים ומנגנוני עמידות ישירות מדגימות מטופלים.
- סריקה: מספקת תוצרים גנומיים כמותיים וניתנים לשחזור המתאימים לפיתוח בדיקות בהמשך התהליך.
- אנליטיקה: מספקת נתוני רצף ברזולוציה גבוהה וניתוח פילוגנטי למחקרים השוואתיים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין גנומיקה קלינית לתיקוף פרה-קליני והתאמת ביומרקרים לצורך ניהול תרופות אנטימיקרוביאליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה ניתנת לשימוש חוזר עבור פתוגנים בקטריאליים מגוונים והקשרי מעקב.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בזיהוי פתוגנים ובפרופיל העמידות שלהם.
- ערך תפעולי: מסנכרן את עיבוד הדגימות והריצוף לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור ובני Scale.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקה של השקעות בתוכניות אבחון ומעקב.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של יעדי מחלות זיהומיות ויוזמות מעקב המותאם לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית, גנומיקה וביואינפורמטיקה לביצוע זרימת העבודה וניתוח נתונים.
- מחייב גישה למכשירי כימות מבוססי פלואורסצנציה רגישים, למכשירים למחזורי תרמיים (thermal cyclers) ולפלטפורמות של ריצוף בתפוקה גבוהה.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים לטיפול בדגימות ולפרשנות נתונים.
- ניתן להתאמה למגוון פתוגנים חיידקיים, אך הביצועים עשויים להשתנות בהתאם לעומס הפתוגנים ולסוג הדגימה.
- ההצלחה בהשגת הגנום מושפעת מערכי ה-Ct של ה-qPCR ומאופטימיזציה של טמפרטורת ההיברידיזציה.
