גישות גנטיות בקדימה כלמידיה trachomatis

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניתוח גנטי על כלמידיה טריטוס על ידי ביצוע מוטגנזה כימית וקביעת אסוציאציות פנוטיפיות גנוטיפיות. זה מושג על ידי יצירת זנים מוטנטיים של כלמידיה טרקום באמצעות מוטגנזה כימית. לאחר מכן, כל המוטציות הכימיות שנוצרות מזוהות על ידי ריצוף גנום שלם, ואחריו הרכבת גנום מונחה ייחוס.

לאחר מכן מזוהים אסוציאציות גנוטיפיות פנוטיפיות בזנים המוטנטיים. לבסוף, האסוציאציות הגנוטיפיות של הפנוטיפ מאושרות על ידי יצירת זנים רקומביננטיים וניתוחם. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כי מוטציה בגן כלמידיה מסוים מובילה לפנוטיפ מעניין באמצעות שילוב של גישות מוטגנזה כימיות קלאסיות והדור הבא של סינג.

כיום אין שיטות זמינות להחלפת גנים בכלמידיה וכלים גנטיים מולקולריים למחקר שלה נמצאים בחיתוליהן. שיטה זו אינה דורשת טרנספורמציה עם DNA רקומביננטי או פיתוח כלים גנטיים מולקולריים, אך משיגה את אותה מטרה. זוהי הקצאת פונקציה לתוצרי גנים בודדים.

להכנת תאים מתורבתים יושבים בערך פעם אחת 10 מתוך ששת תאי הווירוס לכל 25 סנטימטרים בריבוע בשלושה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים מגיעים לשטף כ-24 שעות לאחר מכן, שואבים את המדיום ומדביקים את התאים בכלמידיה בריבוי זיהומים של חמישה. בנפח כולל של שלושה מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S המכיל 200 ננוגרם למיליליטר של ציקלוהקסימיד כדי להתחיל מוטגנזה 18 שעות לאחר ההדבקה מתחת למכסה מנוע כימי, הכינו 20 מיליגרם למיליליטר של אתיל מתאן סולפונאט או EMS ב-PBS עם סידן כלורי ומגנזיום כלוריד.

EMS הוא מוטגן ומסרטן חזק. לכן, עיין בפרוטוקול הטקסט לסילוקו. שאפו את המדיום מתאי ה- Vero ושטפו אותם פעם אחת עם שלושה מיליליטר PBS עם מגנזיום כלוריד וסידן כלורי.

ואז בשלושה מיליליטר של תמיסת EMS ודגירה למשך שעה במכסה המנוע בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את ה-EMS והנח אותו במיכל של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד כדי לנטרל את המוטגן לפני שטיפת התאים שלוש פעמים כדי להסיר שאריות EMS. לאחר מכן בשישה מיליליטר DMEM 10% FBS עם 200 ננוגרם למיליליטר של ציקלו היידה ו-25 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 48 עד 72 שעות.

תכלילים נראים נטולי חיידקים כ-36 שעות לאחר המוטגנזה ב-72 שעות. כ -10% מהתכלילים מלאים בחיידקים ואילו השאר נשארים ריקים כדי לחלץ גופים אלמנטריים או EBS על ידי ליזה היפוטונית, שואבים לחלוטין את המדיום. הוסיפו מיליליטר אחד של מים וסלעים למשך 10 דקות כדי לעקור את התאים, והעבירו את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.

לאחר איסוף הליזאט בצינור מיקרו פוגה, הוסף 0.25 מיליליטר של חמישה x סוכרוז, מאגר פוספט גלוטמט או SPG לריכוז סופי של x אחד ואחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. הגדר שכבות חד-שכבתיות של תאי ves בשש צלחות באר על ידי זריעה של כ-0.4 פעמים 10 מתוך ששת התאים בשלושה מיליליטר של DMEM 10% FBS לבאר מאפשרים לתאים ליצור שכבה חד-שכבתית הומוגנית במהלך 24 השעות הבאות. הסתיו הבא על קרח, תמיסת מלאי של כלמידיה מוטגנית.

לאחר מכן הכינו שישה צינורות של דילול סדרתי פי עשרה בנפח כולל של 200 מיקרוליטר לדילול ב-DMEM 10% FBS, והניחו אותם על קרח. השתמש בשלושה מיליליטר לבאר PBS כדי לשטוף את תאי Vero פעמיים. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של DMEM לכל באר עבור שש צלחות באר ו -100 מיקרוליטר של דילול החיידקים בשכפול.

סובבו את הצלחת כדי להבטיח תערובת אחידה. סובב את הלוחות הנגועים ב-2,700 GS למשך 30 דקות ב-15 מעלות צלזיוס. לאחר מכן דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני לחה של 5% למשך שעה עד שעתיים.

בינתיים, הכינו 0.54%AROS ב-DMEM על ידי שילוב המרכיבים הבאים וערבוב. ובכן אז מערבבים פנימה 18.9 מיליליטר סטרילי חם, 1.2% במים תוך ערבוב למניעת גושים. שמור על התערובת חמה באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס.

שואבים את תרחיף החיידקים מהכלים ומוסיפים שישה מיליליטר מתמיסת הארו החמה. הניחו לו להתמצק לחלוטין בטמפרטורת החדר מחוץ למכסה המנוע. לאחר מכן, במכסה המנוע עם המכסים הוסרו, יבשו את הצלחות למשך 15 דקות נוספות לאחר שהצלחות התייבשו, דגרו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני למשך שבעה עד 10 ימים.

הפלאק צריך להיות גלוי בעזרת מיקרוסקופ מנתח יום אחד לפני בידוד המוטציות. ראה פעם אחת 10 עד ארבעה תאי אפס ב-100 מיקרוליטר לבאר. בצלחת של 96 בארות, התאים יהיו מתכנסים תוך 24 שעות.

תחת מיקרוסקופ דיסקציה, סמן את הלוחות שיש לקטוף ולאחר מכן השתמש בפיפטה סטרילית של מיליליטר אחד כדי לאסוף פקקי פלאק. Resus משהה את הפלאק ב-100 מיקרוליטר של DMEM בתוספת 10% FBS 400 ננוגרם למיליליטר, ציקלו, היידה ו-50 מיקרוגרם למיליליטר. גנטמיצין כדי להרחיב את הזנים המוטנטיים, לכסות את ההשעיה על חד-שכבות קונפלונטיות של תאי Vero.

סובב את הצלחות ב-2, 700 GS ו-15 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הדגירה של dbs קציר כאשר יותר מ-50% מהתאים נגועים, מה שיכול להתרחש כבר 48 שעות לאחר ההדבקה ועד 14 יום. כמות זו של תאים נגועים מאפשרת לאחסן מספיק חיידקים ברי קיימא כדי לחלץ EVs על ידי ליזה היפוטונית של תאים נגועים. לאחר שאיבת המדיום ב -160 מיקרוליטר מים סטריליים ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

השתמש בקצות מחסום כדי לשבש את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח ליזה מלאה. לבסוף, העבירו 160 מיקרוליטר מכל ליזאט לצינורות מיקרו פוגה. מוסיפים 40 מיקרוליטר של חמישה XSPG ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים לבדיקה ולסנן מוטציות לפנוטיפים מעניינים.

חשיפה למוטגן מובילה לתכלילים שנראים נטולי חיידקים ככל הנראה עקב מוות של תאי חיידקים. בדרך כלל, סרובר LGVL 2 יכין לחלוטין תאים נגועים תוך 48 שעות לאחר ההדבקה, אך טיפול במוטגנים יכול להאריך מחזור זה ליותר מ-90 שעות, וכ-10% מהתכלילים צפויים להתאושש בניסויים שלנו. תאי Vero נגועים שטופלו ב-20 מיליגרם למיליליטר של EMS הובילו לירידה של 99% בהתאוששות של צאצאים זיהומיים בהשוואה לבקרות שלא טופלו כפי שניתן לראות באיור זה.

הטיפול במוטגן הוביל גם להופעתם של פלאקים עם מורפולוגיות משתנות, כולל פלאקים קטנים. מורפולוגיות אחרות כוללות לוחות שנראים בצורת גרגירים, גושים או חלת דבש כפי שמוצג כאן. מינוני ה-EMS המשמשים במחקרים אלה יכולים להוביל בין שלוש ל-30 מוטציות לכל גנום KCL כפי שהוערך בניסוי על ידי NGS.

למרות ש-EBS מטוהר בשיפוע נקי ברובו מחומר תא מארח, ה-DNA המארח מזוהה גם הוא ומהווה כ-10 עד 15% מההכנות הגנומיות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע מסננים לפנוטיפים כגון שכפול לקוי בתאי תרבית רקמה, אובדן פעילויות ביוכימיות או שינוי מורפולוגיות חיידקיות על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גורמים חיידקיים נדרשים להיווצרות ותחזוקה של כלמידיה, גורמים פתוגניים.