ייצור מבוסס מיקרוביוריאקטורים של תאי סטרומל מזנכימיים התלויים בעיגון, המוכנים לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה

אנו חוקרים כיצד תאים מתקשרים עם סביבתם, כולל בעת ייצור או ייצור תאים כטיפולים. כאן, אנו מתייחסים לשאלות כיצד ניתן לייצר תאים תלויי עיגון כמו MSCs, סטרומל מזנכימי או תאי גזע, כדי להתגבר על מחסומים מסוימים לתרגום קליני. הכרה גוברת בכך ששונות אוכלוסיית התאים משפיעה הן על עקביות והן על עוצמת המוצר הסופי של התא עבור כל אצווה או אדם.

אתגרים אלה יכולים אף להשפיע על האישור הרגולטורי לחלק מהטיפולים התאים. אנחנו מכוונים לפער שיכול להשיג מספר גבוה של תאים למיליליטר נוזל בשליטה גבוהה על הסביבה ובאופן שניתן להגדיל אותו. פרוטוקול זה מספק דרך לכלול ניטור סביבתי מקורי לתאים התלויים בעיגון, כמו MSCs.

שליטה בתהליכים זו היא יתרון על פני בקבוקים שעדיין משמשים ברוב הייצור המעבדי והקליני. ישנן מספר שאלות פתוחות עבור MSCs וסוגי תאים אחרים הרגישים לרמזים מכניים. לדוגמה, כיצד גישה כזו יכולה לסייע בהנדסת תאים כדי להתמודד עם מצבים מחלותיים אחרים?

כדי להתחיל, הסר את מכסה הפלסטיק השקוף שמחובר לבקבוק LL במתקן הבקבוקים. באמצעות מזרק סטרילי חדש בנפח 50 מיליליטר ללא בומפה, חבר את הפיה לבקבוק LL. שפוך את המים הסטרילים לתוך חבית המזרק והזריק אותם לבקבוק LL. באופן דומה, מלא את הבקבוק L ב-25 מיליליטר DMEM דל סוכר ללא FBS, בקבוק R ב-25 מיליליטר PBS סטרילי, ובקבוק RR בשמונה מיליליטרים של תמיסת שטיפה נגד הדבקה. חזור על התהליך כדי להכין את מספר הצרכנים הנדרש לניסוי.

לאחר מכן, בצע בדיקה עצמית על כל תא לשימוש בניסוי. לאחר שהפוד עבר בהצלחה את כל הבדיקות מהבדיקה העצמית, הסר את קלטות הבדיקה העצמית והניח אותן בשקיות אחסון מוגנות באור. התקן את החומר הצרכן לביוריאקטור.

הסר את הסרט הירוק מהשסתומים המתכלים, והתקן את החומר המתכל בתוך הפוד. התקן מחדש את המהדקים ובדוק אם יש רעש שריקה כדי לוודא שיש אטימה בטוחה. חבר את קו חיישן הלחץ הלבן, קו לחץ האוויר האדום, וקו הוואקום הכחול בין החומר המתכל לתחנת הבסיס או הפוד.

ודאו שפתח ההזרקה הצדדי סגור עם מהדק דמעה לבן לפני שמתחילים ניסוי חדש. לחצו על סמל Flush Bottles בממשק התוכנה. הפעל את כפתור הרדיו לבקבוק L, בחר Output to Waste, ואז לחץ על Start Flush MSCserum.

בחלון תכולת הבקבוקים, ציין ש-MSCserum נמצא בבקבוק R, שמכיל PBS. לאחר מכן עברו ל-Manual Ops ובצעו שלושה מחזורי שטיפת Eject על בקבוק הפסולת. בחלון תכולת הבקבוק מציינים כי MSCserum נמצא כעת בבקבוק RR, המכיל את תמיסת השטיפה נגד הדבקות.

חזור ל-Manual Ops ובצע מחזור שטיפת Eject אחד על בקבוק הפסולת. אחרי 30 דקות, שטוף את המזון עם PBS. רוקן את הכור כדי להמתין להזרקת התא והמיקרו-נשאי.

בפאנל Manual Ops לחץ על Reinoculate. השאירו את המערכת מושהית בשלב שבו לוח המחוונים מציג הודעה לחסון הכור. לאחר מכן, פיפט נפח מחושב של תאים תלויים לצינור חרוטי בגודל 15 מיליליטר המכיל מיקרו-נשאים לכל מצב.

מלא כל צינור ל-2.2 עד 2.5 מיליליטר בתאי גזע מזנכימליים אנושיים טריים וחמים. לעבוד עם אחד או שניים של מוצרי צריכה בכל פעם, להוציא אותם מתחנת הבסיס ולהכניס אותם לארון הבטיחות הביולוגית. משוך את תערובת התא והמיקרו-נשא למזרק של חמישה מיליליטר באמצעות מחט ירוקה קהה בקוטר ארבעה אינץ'.

מזריק את התערובת לכור. אחוז בקו פתח ההזרקה קרוב לבסיס הקסטה תוך זהירות שלא לנתק את הקו. באמצעות תנועת גלגול בין האגודל לאצבע המורה, סובבו את קו פורט ההזרקה לשני סיבובים מלאים כדי ליצור עיקול קשור בקו.

הכנס את הקשר לחלל החיתוך ליד בסיס פתח ההזרקה ואבטח אותו עם חתיכת סרט מעבדה קטן. ואז להחזיר את הצרכוז לתחנת הבסיס. לאחר חזרה על ההזרקה לכל הצרכנים, עברו דרך ממשק התוכנה כדי להצביע על סיום החיסון.

כאשר התוכנה חוזרת לדף הבית, הסר את הקלמפ הלבן מקווי הפלט המתכלים. היכנסו ל-Manual Ops ובצעו את פונקציית Eject Excess כאשר פורט היציאה מוגדר ל-P לצורך פרפוזיה. הפעל מצב מיקס סטטי באמצעות מחזור של 1, 680 שניות דלוק ו-120 שניות כבויה, והגדר את תדר המיקס ל-5 הרץ.

כדי להתחיל באיסוף תאים, השתמשו במזרק של מיליליטר אחד כדי למשוך 200 מיקרוליטר של פרונאז וכ-300 עד 400 מיקרוליטר אוויר. שחרר את המכסה של צינור ההזרקה בצד הפורט וריסס את מחבר השסתומים ללא מחט ב-70% אתנול. הסר את הסרט מקו ההזרקה של פתח הצד הקשוך, שחרר את הקשר ושחרר את מהדק הטירפול הלבן.

עכשיו, חבר את המזרק של מיליליטר והזריק בעדינות את הפרונאז לכור. רדפו אחרי הנוזל עם אוויר כדי להבטיח משלוח מלא. תחבר מחדש את מהדק הטירפול ותסגור מחדש את כבל ההזרקה.

ואז להחזיר את החומר לצריכה לפולד, לחבר מחדש את כל הקווים, להסיר את ה-C-clamp הלבן ולהמשיך לערבב. הנח את בקבוק הפסולת ובקבוק מקור המדיה על קרח. התחל טיימר של חמש דקות ותן לפרונאז לעכל את המיקרו-נשאים בכור.

לאחר חמש דקות, בדוק שהמיקרו-נשאים התדרדרו על ידי בדיקת היעדרותם בכור. קצור את התאים על ידי כניסה ל-Manual Ops, הגדר את מספר המחזורים לשלושה, בחר פורט פלט W לפסולת, ולחץ על 'הוצאת שטיפה'. לאחר סיום מחזורי ה-Eject Wash, העבר את החומר המתכל לארון הבטיחות הביולוגית.

לאחר מכן משכו את תכולת בקבוק הפסולת באמצעות מזרק של 10 או 20 מיליליטרים. שפכו את תכולת בקבוק הפסולת לצינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 15 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות.

שאפו את הסופרנטנט והערכו את גודל כדורי התא. תנאי הסביבה, כולל pH, טמפרטורה, חמצן מומס ופחמן דו-חמצני, נשמרו ביציבות לאורך כל תקופת התרביעה בת 10 הימים במערכת המיקרוביוריאקטור. השינוי ב-pH היה נמוך משמעותית במיקרוביוריאקטור בהשוואה למצב בקבוק פוליסטירן בתרביות רקמה.

תפוקת התאים הייתה גבוהה יותר במיקרוביוריאקטור מאשר בבקבוק T25, תוך שמירה על חיוניות תאית דומה. מתוך 14 תכונות האיכות הקריטית הקשורה לעוצמה שנמדדו, תשעה הראו ביטוי mRNA גבוה יותר באופן משמעותי במצב המיקרוביוריאקטור ביחס לבקבוק T75.