הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי
10 באוקטובר 2025
פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.
מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, דיווחים פלואורסצנטיים וניתוח תמונות דיגיטלי, הם טכנולוגיות המאפשרות הערכה מפורטת של תפקוד הלב העוברי בדגי זברה. שמירה על תנאי דימות עקביים ומזעור תנועת עוברים ממשיכים לאתגר מרכזי למדידות מדויקות של תפקוד הלב. כדי להתחיל, יש להקליט סרטונים של עוברי דגי זברה ב-96 שעות לאחר מכן בפורמטים לא דחוסים, כדי לאפשר ניתוח מדויק של דינמיקת תנועת הלב.
ברצף, לחץ על קובץ, פתח, ואז בחר את קובץ ה-AVI ב-ImageJ לייבוא הסרטונים. השתמש בניתוח, ואז לחץ על Set Scale, הזן את קוטר השדה הידוע, והפעל את האפשרות הגלובלית ליישום הסקאלה על כל המדידות. השתמש בכלי ROI כדי לסמן את הצירים הארוכים והקצרים של החדר במהלך סוף הסיסטולה והקצה הדיאסטולי.
לאחר מכן קבעו את שטח הפנים של החדר באמצעות נוסחת קירוב האליפסה. הערכת נפח החדר בקצה הדיאסטולה ובקצה הסיסטולה באמצעות נוסחת נפח אליפסואיד. כעת חשב את שינוי שטח השבר והקיצור השברירי.
לאחר מכן קבעו את נפח המהלך, SV, ושבר הפליטה, EF. לניתוח אוטומטי, הפעל את תוכנת Z-Embryo Analyzer ולחץ על קובץ, ואז פתח וידאו כדי לייבא את הווידאו הרצוי. לחץ על כפתור Detect Heart כדי לאפשר לתוכנה לאתר אוטומטית את אזור העניין בהתבסס על תנודות בהירות בין פריימים של וידאו. תן לתוכנה לנתח שינויים בבהירות באזור המזוהה כדי להעריך את קצב הלב, ואז לחשב את תפוקת הלב.
הגרפים מראים את שטח ונפח תא החדר שנמדדו בקצה הדיאסטולה ובסוף הסיסטולה בעוברי דגי זברה ב-96 שעות לאחר ההפריה. ההבדלים הכמותיים בין סוף הדיאסטולה לסוף הסיסטולה משקפים תפקוד סיסטולי תקין במהלך התפתחות הלב המוקדמת, ותומכים ביישום שיטה זו. בעוברים בריאים של דגי זברה, נפח השבץ הממוצע היה 0.213 ננוליטרים.
תפוקת הלב הייתה 27.8 ננוליטר לדקה. שיעור הפליטה היה 41.99% וקצב הלב הממוצע היה 130 פעימות לדקה. בעוברים בריאים של דגי זברה, השינוי הממוצע בשטח השברי היה 61.2% והקיצור החלקי היה 44.5%. העוברים החשופים לקדמיום הציגו מורפולוגיה לבבית לא תקינה עם חדרים מוגדלים ובצקת פריקרדיאלית.
בעוברים שנחשפו לקדמיום, נפח השבץ היה גבוה משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת. תפוקת הלב עלתה, וקצב הלב ירד. הפרוטוקול מתמודד עם המחסור בשיטות נגישות סטנדרטיות לכימות תפקוד הלב העוברי של דג הזברה באמצעות תהליכי עבודה ניתנים לשחזור.
פרוטוקול זה עושה שימוש במיקרוסקופיה סטנדרטית ובניתוח קוד פתוח, מה שמאפשר הערכה קרדיאלית איכותית ללא ציוד מיוחד. הממצאים מספקים פרוטוקול אמין המשפר את ההשוואה בין המחקרים ומאפשר הערכה מדויקת יותר של פנוטיפים לבביים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה זולָה של מיקרוסקופיית אור להערכת המורפולוגיה והתפקוד של הלב בעוברים של דגי זבראפיש (zebrafish), המאפשרת הערכה הדירה של רעילות לבבית התפתחותית ללא צורך במערכות דימוי מתקדמות. השיטה מאפשרת ניתוח מפורט של תפקוד הלב באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית ותוכנה בקוד פתוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מורפולוגיה לבבית
- התפתחות עוברית
- טוקסיקולוגיה
רקע
- מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ואנליזה דיגיטלית של תמונות חיוניות להערכת תפקוד לבבי עוברי.
- שמירה על תנאי דימות עקביים היא קריטית לקבלת מדידות מדויקות.
- האתגרים כוללים מזעור תנועת העובר במהלך הדימוי.
- חסרות שיטות סטנדרטיות לכימות התפקוד הלבבי בדגי zebrafish.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול הניתן לשחזור להערכת תפקוד לבבי בעוברים של דגי זברא (zebrafish embryos).
- מתן אפשרות להערכת רעילות לבבית התפתחותית.
- שיפור ההשוואה בין מחקרים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקליטו סרטוני וידאו של עוברי דגי זברה 96 שעות לאחר ההפריה.
- השתמשו ב-ImageJ לצורך ניתוח הווידאו ומדידה של פרמטרים לבביים.
- חשבו את שטח הפנים של הפרונטריקולום, הנפח, נפח הפליטה ואת מקדם הפליטה.
- השתמשו בתוכנת Z-Embryo Analyzer לניתוח אוטומטי של תפוקת הלב.
תוצאות עיקריות
- נפח הפעימה הממוצע בעוברים בריאים היה 0.213 nanoliters.
- תפוקת הלב נמדדה כ-27.8 nanoliters per minute.
- שבר הפליטה נמצא כ-41.99% עם קצב לב של 130 beats per minute.
- חשיפה לקדמיום הובילה למורפולוגיה לא תקינה של הלב ולשינוי בתפקודו.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה להערכה לבבית בעוברים של דגי זברה.
- שימוש במיקרוסקופיה סטנדרטית ובניתוח ממקור פתוח הופכים שיטה זו לנגישה.
- הממצאים תומכים בישימות של שיטה זו להערכת פנוטיפים לבביים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות לבבי כמותי בעוברי דג זבוב מאפשר זיהוי בשלבים מוקדמים של רעילות לבבית התפתחותית, ובכך תומך בהסרת סיכונים חזויה בתהליך גילוי תרופות למערכת לב-דם. תהליכי עבודה סטנדרטיים לניתוח וידאו מספקים תוצאות תפקודיות הניתנות לשחזור ובעלות תפוקה גבוהה, המקלות על תיקוף יעדים חסון ובדיקה מכניסטית. גישה זו משפרת את מיון הפורטפוליו על ידי אפשור הערכה ניתנת להרחבה ויעילה במשאבים של פגיעות לבביות במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה תפקודית של מטרות לבביות במודל חולייתים ניתן לטיפול גנטי.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות ביצועי הלב תחת הפרעה גנטית או כימית.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מטרה באמצעות מדדים לבביים כמותיים וניתנים לשחזור.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין בדיקות לבValidated של דגי זהב (zebrafish) עבור סריקת תרכובות ותהליכי עבודה של רעילות.
- מבטיח אחידות במדידת ממדי החדרים, נפח הפעימה ותפוקת הלב לצורך הדירות של הבדיקה.
- מאפשר הערכה כמותית בעתקת-סריקה גבוהה (high-throughput) של פנוטיפים לבביים באמצעות מכשור נגיש.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרן מדדי קצה תפקודיים מוקדמים של הלב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים במחקר קרדיווסקולרי.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להערכה לבבית ב-in vivo.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות חשיפת סימנים מוקדמים לרעילות לבבית.
שילוב תהליכי עבודה (Workflow) וצינורות עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת תפקוד לבבי מונחית-השערה, סטנדרטיזציה של בדיקות ואנליזה כמותית בעוברים של דג הזברה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס ובבירור נתיבים עבור מטרות לבביות.
- סריקה: מספק מדדים לבביים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליזה: מספק פלטים סטטיסטיים כגון נפח סיסטולי, מקדם פליטה ותפוקה לבבית לצורך השוואת מצבים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי גילוי מוקדמים להערכת בטיחות לבבית פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה למספר תוכניות מחקר קרדיווסקולריות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבוי ומפחית עמימות מנגנונית בתיקוף של מטרות לבביות.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה סטנדרטית, הניתנת לשחזור ובעלת יכולת הרחבה של תפקוד הלב באמצעות כלים נגישים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי חשיפה מוקדמת של ליאביליות לבבית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים קרדיווסקולריים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, מיקרוסקופיה וניתוח תמונות.
- דורש מיקרוסקופ אור פשוט ותוכנות קוד פתוח כגון ImageJ ו-Zembryo Analyzer.
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דימוג וניתוח בין צוותים שונים לצורך שחזוריות.
- ניתן להתאמה להפרעות גנטיות או כימיות שונות בעוברים של zebrafish.
- מוגבל לשלבי התפתחות מוקדמים ועשוי לדרוש אופטימיזציה עבור נקודות קצה לבביות ספציפיות.
