הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה
22 באפריל 2014
הדמיה של כלי דם במוח בפיתוח דג הזברה זחל הוא תאר. טכניקות כדי להקל על ההדמיה 3D ולשנות התפתחות כלי דם במוח באמצעות טיפולים כימיים גם מסופקות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך מבנים מוחיים בדגי זברה עובריים. זה מושג תחילה על ידי איסוף ביצי דגי זברה מופרות, והגדרת תנאי טיפול. לאחר תקופת גידול של שלושה ימים, דגי הזברה מוקרבים קבועים, ועין מוסרת בזהירות לפני הרכבת הדגימה על זכוכית הכיסוי.
ואז כלי הדם המוחיים מצולמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, עיבודים תלת מימדיים של כלי הדם נוצרים באמצעות תוכנת קוד פתוח. בסופו של דבר, ניתוח השחזורים משמש לקביעת ההשפעות של תנאי הטיפול על הסתעפות כלי הדם וצפיפותם.
במוח דג הזברה המתפתח. טכניקה זו מעריכה את כל מערכת כלי הדם של דג הזברה העוברי. זה אפשר לנו לחקור את הביולוגיה של עמילואיד בטא ברמת מערכות האיברים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את הניתוח וניתוח התמונה מכיוון שהם מאתגרים מבחינה טכנית. כדי להתחיל, יש להעלות זן דג זברה טרנסגני המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ברקמות הרצויות ב-28.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 14 שעות ו-10 שעות חושך. בדוגמה זו, דגים טרנסגניים המבטאים EGFP בתאי אנדותל כלי דם גדלים בלילה שלפני איסוף הביצים מקים זכרים ונקבות במיכלי הזדווגות עם תחתית רשת למחרת בבוקר, הסירו את המפריד ואפשרו לדגים להזדווג ולבדוק אם יש ביצים כל 15 דקות.
לאחר שימוש במסננת רשת לאיסוף הביצים ו-E שלוש בינוניות לשטיפתן, השתמש ב-E שלוש כדי להעביר את הביצים לכלי תרבית של 100 מילימטר ולדגור אותן ב-28 מעלות צלזיוס כדי לשנות את הסתעפות כלי הדם במוח. החל מ-24 שעות לאחר ההפריה, הוסף כימיקל כגון מעכב גמא סקרטאז המסיס ב-DMSO. אם תרצה, הוסף 0.03% PTU כדי לעכב היווצרות פיגמנט.
לאחר העברת העוברים בתמיסה לבארות של 12, צלחת באר דוגרת ב-28.5 מעלות צלזיוס עד שהעוברים מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי. לאחר הקרבת עוברים בטריקה וקיבוע אותם עם אלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. אחסן עוברים ב-PBS בחושך בארבע מעלות צלזיוס.
כדי להסיר את העין מהעובר, השתמש במחט טונגסטן מושחזת וחתוך סביב הרקמה המחברת עין אחת. לאחר מכן חתכו את השרירים ולבסוף את עצב הראייה כדי להסיר את העין. לאחר הסרת העין, הפוך את העובר על כיסוי כשארובת העין הריקה שלו פונה כלפי מטה ונוגעת בזכוכית הכיסוי.
הוסף טיפה של 3% מתיל צלולוז כדי להחזיק את העובר במקומו ולכסות את העובר כולו כדי למנוע התייבשות. במהלך הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם תמונת אובייקט APO של תוכנית 20x, העובר באופן מיידי, מערכות הדמיה רבות יוכלו לפתור מבני כלי דם רק באמצע הדגימה הזו. אם זה המקרה, החייאה, השעו את העובר ב-PBS והרכיבו אותו מחדש בצד הנגדי להדמיה נוספת כדי לבצע שחזור תלת מימד של תמונות כלי דם במוח באמצעות תמונה J, המותאמת לעיבודים תלת מימדיים.
ייבא ערימות קונפוקליות על ידי מעבר אל תוספים, מיקומים, יבואן פורמטים ביולוגיים, ולאחר מכן בחר את הקובץ הקונפוקלי עבור מחסניות Nikon בחר הצג מחסנית עם היפר מחסנית והגדר את מצב הצבע לגווני אפור. לאחר מכן בדוק קנה מידה אוטומטי ופיצול ערוצים. בחירות אלה יפתחו ארבעה לוחות ערוצים נפרדים.
סגור את כל התמונות מלבד 16 הסיביות עם שם הקובץ ואחריו c שווה לאחד. התאם את הסף באמצעות לשונית הגלילה לאורך החלק התחתון כדי לסרוק כדי למצוא פרוסה הכוללת את האזור או המבנה המעניינים. לאחר מכן עבור אל סף התאמת התמונה.
בפאנל שעולה, החלק את הסרגל העליון שמאלה כך שניתן יהיה לראות את המבנה די טוב על הרקע והשאיר את השקופית התחתונה במקום שבו היא נמצאת כדי ליצור תמונה חדשה של שמונה סיביות. בחר b ו-w. ואז רקע כהה.
אל תבחר חישוב סף לכל תמונה, אלא אם כן נדרשות התאמות שונות לכל פרוסה. לאחר מכן, עבור אל תוספים 3D Viewer Threshold Zero Reampling Factor אחד או שניים, ובטל את הבחירה בתיבות הצבע האדום והכחול כדי ליצור פלט תלת מימד ירוק. אחרת, הוא יפיק עיבוד לבן.
לאחר מכן בחר החל. השתמשו בלחצני העכבר והמקלדת כדי לסובב, לסובב ולהגדיל את התמונה התלת-ממדית כדי לשמור תמונות סטילס בכל שלב. השתמש באפשרות הלכידה בתפריט.
גודל תיבת התמונה על המסך מכתיב את מידות הפיקסלים של התמונה המופקת, כך שאם רוצים תמונה ברזולוציה גבוהה, הגדילו את התיבה על ידי גרירת הפינה הימנית התחתונה. צרו סרט תלת-ממד מסתובב על ידי בחירה באפשרות 'תצוגה', 'רשום סיבוב של 360 מעלות'. לבסוף, שמור את הקובץ באחד מכמה פורמטים זמינים והשתמש בנגן המדיה החינמי בקוד פתוח VLC לצפייה בתלת מימד.
שחזור מבני כלי דם מספק פרספקטיבה מקיפה ומעניינת מבחינה ויזואלית של התפתחות דגי הזברה. מוצגות כאן מספר זוויות של מבני כלי דם בעובר דג זברה של שישה ימים לאחר ההפריה שביטא EGFP בתאי אנדותל עם צבעים ירוקים או לבנים מונוכרום. זה יכול להיות קשה להעריך את עוצמת האות, אבל צביעה פסאודו מספקת עוצמת תמונה מטבלת חיפוש, מה שמאפשר תפיסת עומק טובה יותר של מבנים חופפים.
לדוגמה, איור זה מציג תמונה תלת מימדית פסאודו צבעונית של כלי הדם בדג זברה של שישה ימים לאחר ההפריה לאחר התפתחותו. הטכניקה הזו אפשרה לנו לחקור את ההשפעות של כלי הדם של עמילואיד בטא במוח של בעלי חוליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין את רשתות כלי הדם בדג זברה עוברי, המספק מערכת חסכונית ונגישה לחקר אנגיוגנזה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקות דימוי להערכת התפתחות כלי הדם המוחיים בזבוב zebrafish בשלב הזחלים. הוא מפרט שיטות לדימוי בתלת-ממד ושימוש בטיפולים כימיים לשינוי מבני כלי הדם המוחיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות דימות
רקע
- מבנים צרברו-וסקולריים הם קריטיים להבנת התפתחות המוח.
- זברופיש בשלב הזחלה משמשים כאורגניזם מודל לחקר מערכות כלי דם.
- טכניקות דימות יכולות לספק תובנות לגבי שינויים וסקולריים כתוצאה מטיפולים.
- זברופיש טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים משפרים את הוויזואליזציה.
מטרת המחקר
- להערכת מבנים צרברוווסקולריים בעוברים של דגי זברה.
- לבחינת ההשפעות של טיפולים כימיים על התפתחות כלי הדם.
- להדגמת טכניקות דימוג למחקר ביולוגיה של כלי דם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף ודגירה של ביצי זבזב (zebrafish) הופריות.
- יישום של טיפולים כימיים לשינוי הסתעפות כלי דם.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לדמיון של מבנים קרב-vaskulariים.
- שחזור תלת-ממדי (3D) של תמונות באמצעות תוכנה בקוד פתוח.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מבנים קרבו-וסקולריים בדגי zebrafish.
- רינדורים בתלת-ממד סיפקו תובנות לגבי התבססות וצפיפות כלי הדם.
- הוכחת ההשפעה של amyloid beta על ההתפתחות הוסקולרית.
- טכניקות ויזואליות שיפרו את ההבנה של רשתות כלי הדם.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה להדמיה של רשתות כלי דם בדגי zebrafish.
- גישה זו בעלת ערך לחקר אנגיוגנזה וביולוגיה של כלי דם.
- מחקרים עתידיים יכולים להבסס את עצמם על טכניקות אלו כדי לבחון שאלות ביולוגיות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של רשתות כלי דם מוחיים במודל חולייתים הניתן למניפולציה גנטית, התומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים של יעדים אנגיוגניים. היא מספקת מדדים וסקולריים כמותיים המגבירים את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור הפרעות כימיות לפנוטיפים מבניים. גישה זו מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשחזור להערכת השפעות וסקולריות של תרכובות נוירו-אקטיביות במערכת רלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות לגבי הסתעפות וצפיפות כלי דם במערכת של חוטר חי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת ויזואליזציה ישירה של השפעות מעורבות המטרה על הארכיטקטורה של כלי הדם המוחית.
- ערך ניבוי: מייצר מדדים מבניים המנחים את רמת הביטחון במטרה ואת תעדוף תיק הפיתוח בהתבסס על פעילות אנגיוגנית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצרת תוצאות כלי דם סטנדרטיות מבוססות פלואורסצנציה, התואמות לתהליכי דימוי קונפוקאלי.
- פלט כמותי: מאפשרת מדידה של דפוסי התבססות וצפיפות של כלי דם עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- ניתנות להרחבה של הפלטפורמה: משתמשת בתוכנה הזמינה באופן חופשי לשחזור תלת-ממדי, מה שמקל על הדירות בין מעבדות ועל העברת הבדיקה.
מחקר תרגומי וטרום-קלמיני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פתופיזיולוגיה של כלי דם מוחיים באדם במערכת של חולייתים עם מסלולי אנגיוגנזה שמורים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לפנוטיפים וסקולריים in vivo, ובכך תומך בתיקוף פרה-קליני של מודיולטורים אנגיוגניים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק נתונים מורפולוגיים להכוונת החלטות go/no-go על בסיס אותות של בטיחות וסקולרית או יעילות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה ועד לאופטימיזציה של המוליך, כאשר פנוטיפים וסקולריים מסייעים להבנה מכניסטית ולקשרי מבנה-פעילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולים אנגיוגניים על ידי קישור הפרעות גנטיות או כימיות למורפולוגיה וסקולרית בתלת-ממד.
- סריקה: מספק נקודות סוף הדימותיות הניתנות לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על היווצרות רשתות כלי דם.
- אנליטיקה: מייצר שחזורי תלת-ממד ונתונים מורפומטריים המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאי טיפול שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים וסקולריים מוקדמים למודלים פרה-קליניים באמצעות מנגנונים שמורים של התפתחות מחסום דם-מוח ואנגיוגנזה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימות הניתנת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפוק וסקולרי בפרויקטים מרובים ובתחומים טיפוליים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באיתות אנגיוגני.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות העבודה של דימות ואנליזה וסקולרית, ובכך משפר את השחזוריות בין צוותים ואתרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של כשלי כלי דם או הזדמנויות טיפוליות.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות פנוטיפיקה וסקולרית אובייקטיבית מבוססת דימות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול דגי זברה, בטיפול במודלים טרנסגניים ובמיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים קונפוקליים עם עדשות מתאימות וסטים של מסנני פלואורסצנציה לזיהוי EGFP.
- מחייב פרוטוקולי קיבוע והרכבה סטנדרטיים כדי לשמר את הפלואורסצנציה ואת שלמות הרקמה לצורך שחזור תלת-ממדי.
- כולל הכשרה בניתוח תמונות בתלת-ממד באמצעות כלים בקוד פתוח כגון ImageJ כדי להבטיח כימות כלי דם עקבי.
- מוגבל על ידי גודל העובר והחדירה האופטית, העלולים להגביל את עומק הדמיה בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות ללא ביצוע הבהרה (clearing) או הדמיה של חתכים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Zebrafish Husbandry, Embryo Generation, and Treatment
2:50
Confocal Imaging of Cerebrovascular Structures in Fixed Zebrafish Embryos
4:07
3D Reconstruction of Embryonic Zebrafish Cerebrovasculature
6:34
Results: 3D Reconstruction of Embryonic Zebrafish Cerebrovasculature
7:26
Conclusion
