אינדוקציה מדויקת והבחנה של רפלקסים של שיעול והתעטשות בעכברים
3 באוקטובר 2025
מחקר זה ביסס מודלים של שיעול והתעטשות בעכברים על ידי הפעלת גירויים ספציפיים על קנה הנשימה וחלל האף, ופיתח שיטה מבוססת שמע להבחנה בין שיעול והתעטשות של עכברים על ידי ניתוח הבדלים באותות האקוסטיים שלהם.
פרוטוקול זה מתמקד ברפלקס נשימתי בעכברים. המטרה שלנו היא לגרות את קנה הנשימה ואת חלל האף כדי לגרום לשיעול והתעטשות, וזה יבחין בין שני סוגי האירועים הללו בהתבסס על תכונות השמע. מחקרים קודמים השתמשו לעיתים קרובות בקפסאיצין נבולי או בחומצה ציטרית כדי לעורר את בדיקת הנשימה והתנהגויות שיעול והתעטשות בעכברים.
עם זאת, עדיין לא ברור אם גירוי בדיקת נשימה על ידי נבוליזציה גורם לשיעול, עיטוש או שניהם, שכן כיום אין שיטה אמינה להבחין בין שתי התגובות הללו. לצורך פרויקט זה, קבענו שיטה לעידוד שיעול ועיטוש על ידי גירוי סלקטיבי של קנה הנשימה או חלל האף. השתמשנו גם בניתוח אקוסטי כדי לזהות את המאפיינים המובחנים בין שיעול לעיטוש.
המחקר המוני שלנו מספק כלי עוצמתי שיתמוך ישירות בפיתוח תרופות עתידיות להפרעות שיעול והתעטשות. כדי להתחיל, חתוך מחט בקוטר 28 לתוך קנולה באורך של כ-5 מילימטרים. באמצעות מלקחיים ונייר שוחק, החליק את שני הקצוות וחבר קצה אחד לצינור סיליקון.
חבר את הקנולה המחוברת בצינור למזרק של מיליליטר אחד, ושוטף את הקנולה במים כדי לוודא את היציבות. לאחר מכן, כופף את הקנולה בזווית של 90 מעלות עם יחס של שתי לשלוש זרועות. הכנס את הזרוע הארוכה יותר לצינור הסיליקון באורך חמישה סנטימטרים.
חלק עכברים באקראי לשלוש קבוצות, כאשר כל אחת מהן שישה עכברים. עכשיו, אבטח את העכבר המורדם במצב שכיבה על השולחן. לאחר גילוח שיער הגולגולת והצוואר הרחם, יש לחטא את האזור ביודופור ואלכוהול.
מתחת למיקרוסקופ, חתכו את עור צוואר הרחם למשך כ-סנטימטר אחד, ונתחו בצורה קהה דרך רקמות ושרירים כדי לחשוף את קנה הנשימה. נקב את הרקמה הרכה בין סחוס הקריקואיד לסחוס קנה הנשימה באמצעות מחט 32 גייג'. לאחר מכן, צור פתח קטן בקנה הנשימה עם מספריים עיניים.
הכנס את הקנולה המתכתית המכוסה בסיליקון בערך מילימטר אחד לתוך הלומן של קנה הנשימה, ואבטח את חיבור הקנולה לקנה הנשימה עם תפר 7-0. כעת, חתך את הקרקפת בערך סנטימטר אחד, וחפור באופן ישיר תת-עורית מהצוואר ועד הגולגולת. נתב את צינור הסיליקון דרך התעלה התת-עורית אל הגולגולת, מקבע אותו על הגולגולת באמצעות מלט דנטלי, ואז תפר את העור.
תפרו את החתך בצוואר הרחם ותנו לבעל החיים להתאושש במשך חמישה ימים. התקן את הגשש האולטרסוני בטבעת אטימה תואמת לפורט והכנס את הגלאי ליציאת תא הפלתיסמוגרפיה של כל הגוף כדי להבטיח מגע אטום. חבר את תא הפלתיסמוגרפיה של כל הגוף לחיישן הזרימה ולמערכת זרימת ההטיה.
חבר צינור סיליקון מקובע בגולגולת לצינור הארכה של 30 סנטימטר, ומניח את העכבר בתא הפלתיסמוגרפיה של כל הגוף. הארכי את הצינור דרך הפתח העליון של החדר ואטום את הפתח באמצעות חימר מודלינג סביב הצינור. בדוק את אטימות האוויר על ידי אישור ששיאי גל הנשימה נופלים בתוך ארבע, פלוס או מינוס שתיים.
חבר מזרק בנפח מיליליטר אחד עמוס בתמיסת קפסאיצין של חמישה מיליליטר לצינור ההארכה, והתקן אותו על משאבת המיקרו-הזריקה. מקם מצלמה מהירה מול החדר. כוון את מרחק המצלמה והפוקוס לתצוגה ברורה, והגדר את קצב הדגימה ל-160 פריימים לשנייה.
עכשיו, במקביל התחילו את הפלטיסמוגרפיה של כל הגוף, האולטרסאונד ותוכנות המצלמה. הפעל את המשאבה להתחיל בהזרקת קפסאיצין, ולרשום ספירות שיעול במשך 10 דקות. הכינו את החיות ואת כל החומרים הנדרשים לתהליך.
לאחר ההרדמה והכנת העכבר, אבטח אותו במסגרת סטריאוטקסית. חטא את אזור הניתוח ביודופור ואלכוהול. חתך את העור מעל הגולגולת ועצם האף, וחשוף את עצם האף, באמצעות סכין מנתח.
באמצעות מיקרודריל, יוצרים חור בגודל 0.5 מילימטר במפגש בין עצם האף לתהליך הצידי של סחוס המחיצה האף. עכשיו, חשפו את רירית האף דרך חור הבר. הרימו בעדינות את רירית האף באמצעות מחט בקוטר 32 כדי לחשוף את חלל האף.
לאחר מכן, התקן את צינור הפוליאתילן לזרוע הסטריאוטקסית. יישר את קצה הצינור בקו ישר עם פתח הבור, וקבע את הצינור לעצם האף בעזרת מלט דנטלי, ואז תפר את העור. הנח את העכבר על כרית חימום ותן לו להתאושש עד שההכרה תחזור.
חבר את תא הפלתיסמוגרפיה של כל הגוף לחיישן הזרימה ולמערכת זרימת ההטיה בהתאם למדריך היצרן. לאחר מכן, התקן את הגשוש האולטרסוני עם אטם מותאם לפורט. הכנס את הגשוש לתא הפלתיסמוגרפיה ואדוק אטימה אטומה לאוויר.
העבר את העכבר לתא הפלתיסמוגרפיה, והארך את צינור הפוליאתילן דרך הפתח העליון. אטימו את הפורט בעזרת חימר מודלינג כדי לאבטח את הצינור. בדוק את אטימות האוויר של התא והתקן את המצלמה כפי שהדגים קודם.
לבסוף, יש לקדם חוט ניילון בקוטר 0.25 מ"מ דרך צינור רך אל חלל האף לעומק של אפס עד שלושה מילימטרים. שמרו חמישה סנטימטרים מהפילמנט חשופים מעבר לצינור הנייד. במהלך כל גירוי, לחץ על קצה החוט החופשי עד שהוא מתכופף לכ-45 מעלות, ומספק כ-0.6 גרם כוח לריר האף למשך שנייה אחת.
חזור על הגירוי פעם כל 30 שניות תוך כדי הקלטת תגובות התעטשות במשך 10 דקות. עכברים שעברו ניתוח קנה נשימה או אף עם גירוי אף מכני ואתגר קנה הנשימה קפסאיצין הגבירו משמעותית את אירועי ההתעטשות והשיעול, בהתאמה. הקלטות פלתיסמוגרפיה של כל הגוף הראו עקבות נשימתיות חד-שיא וכפולות לשיעול שנגרם על ידי קפסאיצין והתעטשות מכנית.
אוסצילוגרמות קול חשפו כי קול שיעול היה בעל עוצמה שיא פתאומית בתחילתו, והוא מרוכז בטווח של אפס עד 30 קילוהרץ. בעוד ששמע עיטוש גדל בעוצמה בהדרגה, נמשך טווח של אפס עד 80 קילוהרץ, ומשך הפעולה היה ארוך יותר. שלב הדחיסה של שיעולים חד-שיאים היה בממוצע כ-32.39 מילישניות, קצר משמעותית משיעול עם שיא כפול, כ-53.17 מילישניות.
שלב הדחיסה הממוצע של עיטושים חד-שיאים היה כ-44.03 מילישניות, בעוד שהעיטושים עם שיא כפול היה בממוצע כ-74.24 מילישניות והיו ארוכים משמעותית. דפוסי שיא בודדים התרחשו ב-77.55% מהשיעולים, בעוד שרק 32.42% מהעיטושים הציגו שיאים בודדים, כאשר דפוסי שיא כפולים ששלטו ב-67.58% משך השמע של עיטוש היה ארוך משמעותית ממשך השיעול, אם כי עם טווחים חופפים. חיתוך של אפרנטים חושיים באף הפחית משמעותית את ההתעטשות שנגרמה על ידי קפסאיצין, בעוד שהשיעול נותר ללא פגע.
סקירה כללית
מחקר זה ביסס מודלים של שיעול ועטש בעכברים על ידי הפעלת גירויים ספציפיים בקנה הנשימה ובחלל האף. פותחה שיטה מבוססת שמע להבחנה בין שיעולים לעטישים בעכברים באמצעות ניתוח ההבדלים באותות האקוסטיים שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- פיזיולוגיה נשימתית
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- מחקרים קודמים השתמשו בקפסאיצין או בחומצה ציטרית בערפלה (nebulized) כדי לעורר תגובות נשימתיות.
- ההבחנה בין שיעולים לעיטשיונים הייתה מאתגרת בשל היעדר שיטות מהימנות.
- הבנת רפלקסים אלו יכולה לסייע בפיתוח טיפולים להפרעות קשורות.
- ניתוח אקוסטי יכול לספק תובנות לגבי המאפיינים של שיעולים ועיטשיונים.
מטרת המחקר
- השראה של שיעול ועטש בעכברים באמצעות גרייה סלקטיבית.
- הבחנה בין תגובות של שיעול ועטש באמצעות מאפיינים קוליים.
- אספקת כלי לפיתוח תרופות עתידי המכוון להפרעות בדרכי הנשימה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של שיעול ועטש באמצעות גירוי של קני הנשימה וחלל האף.
- שימוש בפלתיסמוגרפיה של הגוף כולו לניטור נשימתי.
- ניתוח אקוסטי לזיהוי מאפיינים קוליים מובחנים של שיעולים ועטישים.
- מערך ניסויי הכולל הליכים כירורגיים והקלטה קולית.
תוצאים עיקריים
- נרשמו עליות משמעותיות באירועי שיעול ועטש בעקבות הגירוי.
- זוהו מאפיינים אקוסטיים ייחודיים עבור שיעולים ועטישים.
- פלתיסמוגרפיה של הגוף כולו הראתה עקבות נשימה בעלי שיא בודד וכפול.
- ניתוח שמע חשף הבדלים בטווח העוצמה והתדר בין שיעולים לעטישים.
מסקנות
- המודלים המבוססים מבדילים ביעילות בין שיעולים לעיטושים בעכברים.
- מחקר זה מספק בסיס למחקרים עתידיים על הפרעות נשימה.
- ניתוח אקוסטי יכול להוות כלי בעל ערך במחקר של מערכת הנשימה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבחנה בין רפלקסי שיעול ועטש בדיוק אנטומי ואקווסטי נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף של מטרות נשימתיות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור תרפיה של דרכי הנשימה. מודל זה מאפשר הפרדה ברמת ביטחון גבוהה בין פנוטיפים נשימתיים חופפים, ובכך תומך בפיתוח של סממנים ביולוגיים חזויים ובהערכה פרה-קלינית חסונה. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיק הפיתוח על ידי אספקת נקודות סיום כמותיות וניתנות לשחזור עבור מודולציה של רפלקסי נשימה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פארמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מדויקת של מסלולי הגנה בדרכי הנשימה על ידי בידוד רפלקסי השיעול והעיטוף.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות גרייה ספציפית מבחינה אנטומית ומדדים כמותיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין פנוטיפים נשימתיים חופפים.
- משפר את רמת הוודאות החזוית לבחירת מועמדים בתהליכי גילוי תרופות למערכת הנשימה.
סקר ופיתוח בדיקה
- מספק מודלים מתוקפים וניתנים לשחזור לכימות אירועי שיעול ועיטוש in vivo.
- מבצע סטנדרטיזציה של נקודות קצה אקוסטיות ופלתיזמוגרפיות עבור תהליכי סינון המשכיים.
- מאפשר הערכה רחבה ובעלת תפוקה גבוהה של תרכובות מועמדות המכוונות לרפלקסים של דרכי הנשימה.
- מספק פלטים כמותיים המתאימים להשוואה בין מחקרים ובין צוותים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לרפלקסים של דרכי הנשימה הרלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים.
- מבטיחה המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מיפוי של חתימות פיזיולוגיות מובחנות.
- תומכת בהחלטות קידום מבוססות התאמה לסיכון, על בסיס נקודות סיום (endpoints) חסונות וכמותיות.
- מפחיתה עמימות טרנסלציונלית על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים מעוגנים מנגנונית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך זיהוי מוביל (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מספקת פלטפורמה רב-פעמית למחקרי רפלקסים נשימתיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים עבור מנגנוני הגנה של דרכי הנשימה.
- סריקה: מספקת פלטים אקוסטיים ונשימתיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה והבחנה סטטיסטית בין אירועי שיעול לעומת עיטוש.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין מחקרים פרה-קליניים לתרגומיים על ידי התאמת פלטי המודל לנקודות קצה קליניות של מערכת הנשימה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת סטנדרטית וניתנת להרחבה למחקר נשימה שוטף ולהערכת תרכובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נשימתיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות רפלקס נשימתי.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלות של המשך או הפסקה (go/no-go) ובניהול יעיל של תיק הנכסים מבחינת הון.
- השפעה על תיק הנכסים: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של מועמדים לטיפולים נשימתיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות כירורגיות בעכברים ובפיזיולוגיה של מערכת הנשימה.
- נדרשת גישה לתשתית של פלתיסמוגרפיה של הגוף כולו, וידאו במהירות גבוהה והקלטה קולית אולטרסונית.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים של פרוטוקולי הגירוי וההקלטה.
- התאמה למינים אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות מורכבות כירורגית וצורך בכלים אנליטיים ייעודיים.
