פרוטוקול לפירוק תאים בודדים, ריצוף RNA ובידוד תאי מיואפיתל ופיברובלסטים מבלוטות הלמתי והרוק המזדקנות

המעבדה שלי חוקרת כיצד שינויים הקשורים לגיל ברוק ובבלוטות דמעות משפיעים על סוגי תאים שונים באמצעות ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאים. שיטות פירוק סטנדרטיות משחזרות תאים אפיתליים עדינים מבלוטות רוק ודמעות מזדקנות. והפרוטוקול שלי משפר את חיוניות התאים ומאפשר ניתוח תא יחיד אמין ומיון תאים.

כדי להתחיל, מקם את העכבר המושחת על שכיבה על שולחן הניתוח. באמצעות מלקחיים ומספריים דקים, חתכו את העור שבין העין לאוזן. משכו בעדינות את העור כדי לחשוף את בלוטת הדמעות.

בעזרת מלקחיים עם קצה קהה, הרם מעט את בלוטת הדמעות. הפרדו בזהירות את רקמת החיבור הסובבת על ידי גירוי עדין בתנועה מעגלית. זהה את הגבולות הנראים של בלוטת הדמעות והפריד אותן מהרקמות הסמוכות, כולל בלוטת הפרוטיד.

לאחר מכן העבר את בלוטת הדמעות לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה שני מיליליטרים של PBS קר על קרח. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הסר את השומן שנותר והוציא בזהירות את קפסולת הרקמה המחברת מבלוטת הדמעה. הנח צלחת פטרי סטרילית בקוטר 35 מ"מ על הקרח.

הוסיפו 800 עד 1000 מיקרוליטר של PBS קר למרכז הצלחת והעבירו בלוטת דמעות אחת ל-PBS. ודאו שהרקמה נשארת טבולה ב-PBS. באמצעות שני סכינים סטריליים, טחנו בדק את בלוטת הדמעות לחתיכות קטנות עד שהיא מגיעה למרקם רך דמוי משחת.

אסוף את שברי הרקמה לצד אחד של הצלחת. שאפו את שארית ה-PBS ושטפו את השברים עם מיליליטר אחד של PBS קר טרי. העבר את שברי הרקמה השטופים ללוח של 12 בארות המכיל שני מיליליטרים לכל באר של מדיום עיכול מחומם מראש.

מניחים את הצלחת באמבט מים רועדים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-60 סיבובים לדקה למשך 30 דקות. באמצעות קצה פיפטה רחב-קוטר בנפח מיליליטר אחד, יש לפרק בעדינות את הרקמה 15 פעמים. החזירו את הצלחת לאמבטיית המים הנערערת ודוגרו למשך 30 דקות נוספות.

לאחר מכן, באמצעות קצה פיפטה רגיל בנפח מיליליטר, חצו בעדינות את הדגימה 10 פעמים ודגרו שוב למשך 30 דקות. לאחר מכן, פרקו בעדינות את הדגימה 10 פעמים והעבירו את תליית התא לצינורות מיקרו צנטריפוגה של דולפינים בנפח שני מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של מדיום חוסם קר, או BM1, לכל באר בצלחת כדי לאסוף את שארית מדיום העיכול המכיל תאים שאריתיים, והניח את הצלחת על קרח עד לשלב הבא.

צנטריפוגה את הצינורות המכילים את מתליית התא בטמפרטורה של 300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט מכל צינור. העבר את BM1 מכל באר של הלוח המכיל תאים שאריתיים אל הצינור המתאים.

לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של BM1 קר לכל באר כדי לשטוף את התאים הנותרים ולהעביר את השטיפה לצינור המתאים כדי להשתלב עם תליית התא. תלה בעדינות את המתלה של התא. צנטריפוגה את הצינורות שוב ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.

הוסיפו מיליליטר אחד של אקווטאז לכדורי התאים והחזירו בעדינות את התאים. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-60 סיבובים לדקה למשך חמש עד עשר דקות. באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד, חתוך בעדינות את הדגימה 10 פעמים.

לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של BM2 קר לצינור כדי לסיים את התגובה האנזימטית על ידי דילול האקוטאז. צנטריפוגה את הצינור ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס וזרקו את הסופרנטנט. הוסיפו מדיום המכיל DNase 1 בריכוז של 200 יחידות למיליליטר לצינור כדי להחזיר את התאים ולמלא את הצינור עד למעלה.

דגרו את הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והחזירו אותו בעדינות פעם אחת אחרי חמש דקות. בינתיים, הניחו מסננת תאים בנפח 70 מיקרומטר מעל צינור חרוטי של 15 מיליליטר, והרטיבו מראש את המסננת במיליליטר אחד של BM3. לאחר הדגירה, העבירו את תליית התא למסננת.

הוסיפו מיליליטר אחד של BM3 לצינור האיסוף המקורי כדי לשטוף אותו ולהעביר את השטיפה לאותו מסננת. שטפו את המסננת עם חמישה מיליליטר נוספים של BM3. לבסוף, קבעו את ריכוז התאים ואת היתכנות המתלה המסונן באמצעות צבע כחול טרייפן ומונה תאים אוטומטי.

המשך עם יישומים במורד הזרם, כגון ריצוף RNA חד-תאי לפרופיל ביטוי גנים, או מיון תאים מבוסס ציטומטריה זרימה של אוכלוסיות תאים מסומנות פלואורסצנטית. ניתוח UMAP של נתוני ריצוף RNA חד-תאיים זיהה אוכלוסיות אפיתליות וסטרומיות מיוצגות היטב בבלוטת הדמעות, כולל תאי מיואפיתל ופיברובלסטים, וכן אוכלוסיות תאי חיסון מגוונות. בלוטות דמעות מזדקנות הכילו שפע של פלזמה ותאי B מופעלים המבטאים IGHM ו-IGHD.

שער ציטומטריה זרימה סדרתית אפשר הפרדה ברורה של תאי המיואפיתל החיוביים ל-EpCAM, תאי המיואפיתל החיוביים ל-GFP לבין תאי קיר EpCAM שליליים וחיוביים ל-GFP. פיברובלסטים חיוביים ל-GFP שהביעו PDGFR אלפא היו שליליים ל-EpCAM, מה שאפשר הבחנה בין תאי אפיתל. בעכברי PDGFR אלפא, EGFP, כל התאים החיוביים ל-GFP גם הביעו קולגן אחד, מה שמאשר את זהות הפיברובלסטים.

ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי 99.6% מהתאים החיוביים ל-GFP תואמים לתאים עם צביעת חיסון PDGFR אלפא. פרוטוקול זה נועד לבודד תאים בודדים בריאים מבלוטות דמעות לצורך אפיון מולקולרי של אוכלוסיות אפיתליות, סטרומליות וחיסוניות. האתגר המרכזי הוא למזער את הלחץ המכני והאנזימטי במהלך ניתוק רקמות מזדקנות שבריריות, תוך שמירה על חיוניות גבוהה של תאים לריצוף RNA חד-תאים.

לאחר הליך זה, תאים מבודדים יכולים לשמש לריצוף RNA חד-תאים, ריצוף RNA בכמויות גדולות ופרופיל מולקולרי של אוכלוסיות תאים ספציפיות. תאים ממוינים יכולים גם להיות מתורבתים לבדיקות פונקציונליות במורד הזרם.