Immunoblot ניתוח

אימונו-בלוטינג (Immuno blotting), המכונה לעיתים קרובות Western blotting, משמש לזיהוי אנטיגנים ספציפיים המוכרים על ידי נוגדנים פוליקלונליים או מונוקלונליים בתוך דגימת חלבון. הליך זה מתבצע בדרך כלל לאחר אלקטרופורזה של ג'ל בממד אחד או שניים (1D או 2D), וכולל העברה של חלבונים מופרדים לממברנות ניטרוסלולוז. השלב הבא כולל הדגרה של ממברנות אלו עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, המחוברים באופן ישיר או עקיף לאנזימים, וויזואליזציה של אנטיגני החלבון על הממברנות באמצעות תגובות של סובסטרט צבוע או פלואורסצנטי.

בסרטון זה, אנו מספקים הדגמה שלב-אחרי-שלב של פרוצדורת אימונו-בלוטינג (immuno blotting). שלום, אני שון גלאגר מ-UVPI, המשתף פעולה עם מרכז פרוטאומיקה כאן ב-KE Graduate Institute. היום אדגים לכם ניתוח באמצעות אימונו-בלוטינג.

התהליך כולל מספר שלבים, ביניהם הפרדת חלבונים, העברה (blotting) של החלבונים לממברנות, סריקה אימונולוגית (immuno probing) והדמיה באמצעות סובסטראטים כרומוגניים וכימולומינצנטיים. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הליך ה-immuno blotting, יש להפריד תחילה את דגימות החלבון באמצעות אלקטרופורזה, תוך שימוש בגילים חד-ממדיים או דו-ממדיים בגודל קטן או סטנדרטי.

הכינו את הדגימות האנטיגניות והעמיסו אותן לתוך נתיבי הג'ל, כולל חלבון צבוע מראש או חלבון ביוטינילי, וסממני משקל מולקולרי באחד או יותר מנתיבי הג'ל. סממנים חלבוניים אלו יעברו לממברנה ויצביעו באופן נוח על כיוון הממברנה ועל גדלי החלבונים לאחר צביעה אימונולוגית. עם השלמת האלקטרופורזה, ניתן להרכיב את ה-immuno blot.

להרכבת האימונו-בלוט (immuno blot), ראשית, פרקו את "סנדוויץ' הג'ל" והסירו את ג'ל הערימה (stacking gel). השריו את הג'ל למשך 30 דקות בטמפר העברה בטמפרטורת החדר; השריה זו נדרשת כדי למנוע שינוי בגודל הג'ל במהלך ההעברה. בזמן שהג'ל עובר השריה, התחילו בהרכבת "סנדוויץ' ההעברה" בתוך תבנית גדולה מספיק כדי להכיל את קסטת ההעברה מפלסטיק, מלאו אותה בטמפר העברה כך שהקסטה תהיה מכוסה. כעת, הניחו רפידת סקוץ׳-ברייט (scotch bright) או ספוג בחלק התחתון של קסטת ההעברה מפלסטיק.

לאחר מכן, קחו דף נייר מסנן שנגזר לגודל זהה לג'ל. הרטיבו אותו מראש עם תמיסת העברה (transfer buffer) והניחו אותו על גבי פד הסקוץ' ברייט (scotch bright pad). עם סיום זמן השיווי של הג'ל (30 דקות), הניחו את הג'ל על גבי נייר המסנן.

הססרו בועות אוויר שנמצאות בין הג'ל לנייר המסנן על ידי גלגול עדין של מבחנה או מוט זכוכית על פני השטח של הג'ל. לחלופין, ניתן להשתמש בגלגל של BioRad, המגיע עם ערכת BioRad. זכרו להשתמש בכפפות בעת טיפול בניירות מסנן, ג'לים וממברנות.

שומן מהידיים יחסום את ההעברה. כעת, הכין את ממברנת ההעברה. גזור את הממברנה לגודל זהה לג'ל, בתוספת של מילימטר אחד עד שניים בכל קצה.

לאחר מכן, מקמו את הממברנה בתוך מים מזוקקים באיטיות, כאשר קצה אחד נמצא בזווית של 45 מעלות; המים ייספגו בממברנה ובסופו של דבר ירטיבו את כל פני השטח. אם הממברנה תוחדר למים במהירות רבה מדי, בועות אוויר ייכלאו ויופיעו ככתמים לבנים על הממברנה. החלבון לא יעבור לאזורים אלו.

לאחר שהממברנה רטובה לחלוטין, יש להשריות אותה בבפר העברה למשך 10 עד 15 דקות לצורך שיווי משקל. הליך ההרטבה זה מתאים לממברנות ניטרוסלולוז וניילון. רק ממברנות PVDF הן הידרופוביות ולא יירטבו מעצם הנחתן במים מזוקקים או בבפר העברה.

יש להשרות תחילה ממברנות PVDF במתנול 100% למשך אחת עד שתי שניות, ולאחר מכן להביא לאיזון למשך 10 עד 15 דקות בבופר העברה. אין להניח לממברנה להתייבש בשום שלב.

אם הדבר קורה, הרטב שוב עם methanol ולאחר מכן עם תמיסת ההעברה (transfer buffer). ברגע שהממברנה מוכנה, הנח את הממברנה המרוטבת ישירות על הצד העליון של הג'ל. זכור להוציא את כל בועות האוויר שבין הג'ל לממברנה על ידי גלגול עדין של מוט זכוכית של מבחנה או גלגל BioRad על פני השטח של הממברנה.

הרטיבו שוב פיסת נוספת של נייר סינון Watman בעובי 3 mm. לאחר מכן, הניחו אותה מעל לממברנה והסִירו שוב את כל בועות האוויר. לאחר מכן, הניחו פד סקוץ'-ברייט או ספוג נוסף מעל נייר סינון זה.

השלימו את הרכבת "סנדוויץ'" האימונו-בלוט על ידי נעילת החלק העליון של קסטת ההעברה במקומה. כעת, לאחר ש"סנדוויץ'" האימונו-בלוט הורכב, ניתן להעביר את החלבונים מהג'ל לממברנה. כדי להתחיל בהליך ההעברה, מלאו את מיכל האילקטרו-בלוטינג בבופר העברה והניחו את קסטת ההעברה המכילה את ה"סנדוויץ'" בתוך מכשיר האילקטרו-בלוטינג.

חשוב להרכיב את ה"סנדוויץ'" כך שהממברנה תפנה לכיוון האנודה או לצד הטעון חיובית של המיכל. חברו את מוצאי ספק הכוח לצדי האנודה והקתודה המתאימים של מכשיר האילקטרו-בלוטינג (electro blotting). מכשיר הבלוטינג הספציפי הזה מגיע עם בלוק קירור קרח.

כעת, בצעו העברה אלקטרופורטית של חלבונים מהג'ל לממברנה למשך 30 עד 60 דקות במתח של 50 volts עם קירור, או למשך הלילה במתח של 14 volts בחדר קר. עם סיום ההעברה, כבו את ספק הכוח ופרקו את המכשיר. לאחר מכן, הוציאו את הממברנה ממכשיר הבלוטינג וסמנו את הכיוון על ידי חיתוך של אחת הפינות.

בשלב זה, ניתן לייבש את הממברנות ולאחסנם בשקית פלסטיק נסגרת בטמפרטורה של 4°C למשך שנה אחת. לפני המשך העיבוד, יש להטביל ממברנות PVDF מיובשות בכמות קטנה של 100% methanol כדי להרטיב את הממברנה, ולאחר מכן במים מזוקקים כדי להסיר את ה-methanol.

לאחר סימון an orientation, צבעו את הג'ל כדי לוודא את יעילות ההעברה. כדי להנחית את החלבונים שהועברו, ניתן לצבוע את ממברנת באופן הפיך באמצעות cipro ruby, או באופן בלתי הפיך באמצעות kamasi blue India ink, naphthol blue, או זהב קולואידלי. הליכי צביעה בלתי הפיכים אלו אינם תואמים לממברנות ניילון.

כעת, לאחר שהחלבונים הועברו לממברנה, התקדמו לשלב הדיגום האימונולוגי והזיהוי הוויזואלי של החלבונים. בשלב זה, חלבונים המקובעים על הממברנה נסרקים באמצעות נוגדנים ספציפיים כדי לזהות ולכמת אנטיגנים נוכחים. כדי להתחיל, הנח את הממברנה בתבנית דגירה מפלסטיק עם 20 milliliters של תמיסת חסימה (blocking buffer).

יש המשתמשים בשקיות, אך לעיתים קרובות נעשה שימוש במגשים, שכן הם שימושיים במיוחד בעת עיבוד של מספר רב של רצועות בתמיסות שונות של נוגדן ראשוני. לאחר מכן, דגרו את הממברנה האטומה למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, תוך כדי ערבוב על שייקר אורביטלי או פלטפורמה נדנדת. בזמן דגירת הממברנה, דללו את הנוגדן הראשוני ואת תמיסת החסימה.

הדילול נקבע באופן אמפירי, אך הוא בדרך כלל בין 1:100 ל-1:1000. עבור נוגדן פוליקלונלי, הדילול הוא בין 1:10 ל-1:100 עבור תעלילי על של היברידומה, ויותר מ-1:1000 עבור נוזלים עכוריים של עכברים המכילים נוגדים מונוקלונליים. עם סיום הדגירה, יש לשפוך את בופר החסימה.

החליפו את הבופר בנוגדן ראשוני מהול, ושוב, הדגירו למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר תוך써 ערבוב מתמיד. לאחר מכן, שטפו את הממברנה ארבע פעמים על ידי ערבוב עם 100 milliliters של TTBS עבור מסנני NITROCELLULOSE או PVDF, או TBS עבור מסנני ניילון.

שטפו במשך 10 עד 15 דקות בכל פעם ששוטפים את הממברנה; דללו את הנוגדן המשני בבופר חסימה (blocking buffer). דוגמאות לנוגדים משניים כוללות horse radish peroxidase או alkaline phosphatase, anti IG conjugate, או נוגדים מצומדים לאנזימים הזמינים מסחרית. נוגדים משניים מדוללים בדרך כלל ביחס של 1:200 עד 1:25,000 לפני השימוש.

לאחר סיום שלבי השטיפה והשלכת חומרי השטיפה, יש להוסיף חרחור (conjugate) של horse radish peroxidase או alkaline phosphatase נגד IG מדולל, ולהדגיר למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבול קבוע. לאחר 30 עד 60 דקות, הוצא את הממברנה מהמיכל ושטוף אותה ארבע פעמים, למשך 10 עד 15 דקות בכל פעם, ב-TTBS כפי שתואר קודם לכן.

לאחר השלמת השטיפות, ניתן להמשיך לשלב הוויזואליזציה. אך תחילה, נדגים פרוצדורת בדיקה אימונולוגית (immuno probing) חלופית. פרוצדורה חלופית זו מבוססת על ערכת Vector stain ABC מבית Vector Labs.

השיטה משתמשת בקומפלקס אווידין-ביוטין כדי להצמיד פרוקסידאז מחסורית (horse radish peroxidase), או HRPO, או פוספטאז אלקלין (alkaline phosphatase), AAP, לנוגדן המשני המביוטין. היום נדגים את ערכת ה-HRPO. TTBS מתאים מאוד כבופר חסימה למערכות אווידין-ביוטין.

אולם עבור מסנני ניילון, מומלץ להשתמש בריאגנטים לקשירת חלבונים, כיוון שחלב רזה ללא שומן מכיל ביוטין שיורי, אשר יפריע לבדיקה האימונולוגית. יש להשתמש בו בשלב החסימה בלבד כדי להתחיל להביא את הממברנה לשיווי משקל בבופר חסימה במגש פתוח תחת ערבוב מתמיד באמצעות שייקר אורביטלי או פלטפורמת נדנדה. דגרו את הממברנה למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר בזמן שהממברנה מגיעה לשיווי משקל.

הכינו את תמיסת הנוגדן הראשוני. השתמשו ב-TTBS עבור ממברנות NITROCELLULOSE או PVDF עם מערכות Aden. Biotin בעלות רגישות גבוהה.

דילול של סרה המכילה נוגדן ראשוני נע בדרך כלל בין 1:1000 ל-1:100,000. שימוש בכימיה כימילומנצנטית דורש את טווח הדילולים הגבוה יותר. במקרה שלנו, נדגים שימוש בשיטה כרומוגנית.

אנו משתמשים בדילול של 1 ל-5,000 של הנוגדן הראשוני. עם סיום השיווי המשקלי (equilibration), הסר את תמינת החסימה (blocking buffer). לאחר מכן, הוסף מספיק תמיסה של נוגדן ראשוני כדי לכסות את הממברנה.

דגרו את הממברנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נענוע עדין. שטפו את הממברנה של הניטרוצלולוז שלוש פעמים ב-TTBS במרווחי זמן של חמש דקות. במהלך שלב השטיפה, הכינו את תמיסת הנוגדן המשני הביוטיני על ידי דילול טיפה אחת של נוגדן ביוטיני ב-10 milliliters של TTBS. עם סיום שלבי השטיפה, הוסיפו את תמיסת הנוגדן המשני.

דגרו את הממברנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך써נדנוע איטי, בעוד הממברנה מדגרת עם נוגדן משני. הכינו את ה-avadon biotin HRPO לצורך כך. ערבבו שתי טיפות של vti stain reagent A ושתי טיפות של reagent B לתוך 10 milliliter.

TTBS עבור ניטרוסלולוז. יש להדגיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם סיום ההדגירה של הנוגדן המשני. יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים לאורך 15 דקות באמצעות TTBS או TBS.

בשלב הבא, יש להוסיף לממברנה את תמיסת אנזים ה-avidan biotin ולהדגיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי נדנוד איטי. לאחר מכן, יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במרווחי זמן של 10 דקות באמצעות TTBS. כעת, עם השלמת הליך הבדיקה האימונולוגית, החלבונים הקשורים לממברנה מוכנים להדמיה באמצעות סובסטראטים כרומוגניים.

עבור שלב הוויזואליזציה הסופי, התסמינים CN dab/ICL 2 ו-TMB נמצאים בשימוש נפוץ בפרוצדורות של זיהוי אימונולוגי המבוססות על horse radish peroxidase. אם שטיפת הממברנה הסופית במהלך פרוצדורת האימונו-פרוב בוצעה ב-TTBS, שטפו את הממברנה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ב-50 milliliters TBS. כעת, הניחו את הממברנה בתוך תמיסת הוויזואליזציה הכרומוגנית.

פסי חלבון אמורים להופיע תוך 10 עד 30 דקות. לאחר דגירה של 30 דקות, יש להשליך את תערובת תגובת הסובסטרט ולהפסיק את התגובה על ידי הוספת מים מזוקקים. אימונו-בלוטינג הוא הליך רב-שלבי המשמש אלפי מעבדות כדי לזהות נוכחות של חלבונים ספציפיים בעקבות אלקטרופורזה חד-ממדית או דו-ממדית (2D).

הראיתי לכם כעת כיצד לבצע אנליזה אימונולוגית של דם. זהו כל התהליך. בהצלחה בניסוייכם ותודה שצפיתם.