מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות נוגדנים נגד גורמים זיהומיים מקריים (adventitious infectious agents) בבעלי חיים במעבדה. דבר זה מושג על ידי דגירה של סרום לבדיקה עם מיקרוספירות מצופות באנטיגן. לאחר מכן, הסרום מדוגר עם נוגדן אנטי-אימונוגלובולין ספציפי למין המסומן בביוטין, המזהה כל קומפלקסים חיסוניים של אנטיגן-נוגדן.

לאחר מכן, מוסיפים תמיסת FICO eryn Fluor force המסומנת בסטרפטאווידין כדי לזהות כל אימונוגלובולין ביוטינילי, והתוצאות המתקבלות מראות סטטוס נוגדנים חיובי או שלילי עבור פתוגנים נפוצים במכרסמי מעבדה, בהתבסס על פלואורסצנציה מרובה (multiplex fluorescence), ציון נטו של בדיקה אימונולוגית וערכי דגימה פלואורסצנטיים. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון ELISA, הוא ש-MFIA היא בדיקה מרובה (multiplex assay). הדבר מאפשר לחוקר לסרוק עד מאה בדיקות שונות בבדיקה אחת.

טכניקה זו מפחיתה את כמות תחומי הסרום ואת השימוש בחומרים מתכלים בהשוואה לשיטות הקיימות, תוך הגדלת כמות המידע המופק מבדיקה בודדת. הרעיון להשתמש בשיטה זו עלה כאשר בדקנו מספר רב של דגימות סרום עבור סוכנים מרובים ורצינו לצמצם את העבודה ואת זמן הבדיקה. את הפרוצדורה תדגים דונה כהן, טכנולוגית בכירה מהמעבדה שלנו. לתחילת העבודה, הכינו שני באפרים הדרושים לפרוצדורה של MFIA (Multiplex Fluorescence Immunoassay).

הראשון הוא מדלל ראשוני, הזמין מרשת Charles River ומכיל חומרי חסימה קנייניים להפחתת אינטראקציות לא ספציפיות עבור בופר השטיפה של הבדיקה. הכין תמיסת PBS עם 1%BSA pH 7.4 כדי להסיר חלקיקים. סנן את הבופר דרך יחידת סינון לראש בקבוק של 0.2 micron לתוך מכלים סטריליים ומסומנים תוך שימוש בבופר השטיפה של הבדיקה.

הכינו ריכוזי פי 2 של נוגדני antis ביוטיניליים, IGG או BAG, ושל strep AVID ו-FICO erything או SPE, אשר ישמשו לסמן את קומפלקסי האנטיגן-נוגדן שנוצרו במהלך שלב האינקובציה של הסרום הנבדק. להכנת הדגימות, הכינו את החומרים והמתכלים הבאים: מיקרופיפטים רב-ערוציים וחד-ערוציים עם טיפים תואמים, ולוחיות מיקרוטיטר ב-96 בארות עם קישור נמוך לחלבונים (low protein binding) לצורך דילול החלבונים. לאחר איסוף דגימות הדם ובידוד הסרום, ערבבו את הסרום קצרות במערבל וורטקס לפני דילול הדגימות בדילול ראשוני בלוחית מיקרוטיטר בעלת 96 בארות, כדי להבטיח ריקון תקין ואחיד של הבארות. הרטיבו מראש כל בארה בלוחית הבדיקה בתמיסת שטיפה של הבדיקה, ושאבו את התמיס לאט לאורך כל הבדיקה.

יש לבצע שאיבה למשך 5 עד 10 שניות כדי למנוע אגרגציה של חרוצים ודחיסתם אל תוך ממברנת המסנן, שניהם עלולים להאט את זמני הקריאה בסוף הבדיקה. יש לוודא שהניקוז של הנוזל פסק על ידי ספיגת שאריות נוזלים מהצד התחתון של פלטת הבדיקה באמצעות נייר סופג. חשוב לספוג את פלטת הבדיקה לאחר כל שלב שטיפה כדי למנוע ספיגה קפילרית של הנוזל מחוץ לבארות במהלך האינקובציה.

להכנת החרוצים, התחילו בערבוב של תרחיף החרוצים המצומדים באמצעות וורטקס. לאחר מכן, בצעו סוניקציה קצרה באמבט. חשוב לתלות את החרוצים מחדש בצורה נכונה כדי למנוע היווצרות של מקבצי חרוצים מצומדים, שעלולים להוביל לזמני קריאה ארוכים יותר.

בשלב הבא, העבירו את תרחיף המלאי בריכוז 20x לתמיסת חרוצים בריכוז עבודה של 2x בדילואנט ראשוני. לאחר מכן, העבירו 50 µL של תרחיף החרוצים בריכוז 2x לכל באער של פלטת הבדיקה שהורטבה מראש. פלטו 50 µL מכל סרום בדיקה וסרום ביקורת בריכוז 2x לפלטת הבדיקה, בהתאם למפת פלטה שהוגדרה מראש.

הדק את המכסה לפלטה. כסה אותה בנייר אלומיניום והדגר את פלטת הבדיקה למשך 60 דקות על מנער אורביטלי בטמפרטורת החדר, כדי למנוע התאיידות של התמיסות העלולה לפגוע בהצלחת הבדיקה. השאר את פלטת הבדיקה מכוסה במכסה הפלטה במהלך כל שלבי ההדגרה.

בנוסף, מהירות הניעור צריכה להיות גבוהה מ-400 אך נמוכה מ-700 RPMs, כדי שהחרו지를 יישארו בתהליכי סספנסיה (suspension) המאפשרים לנוגדני הסרום גישה לכל משטחי האנטיגנים המצומדים. לאחר שטיפת הפלטה באינקובציות רצופות של החרוזים עם BAG ו-SPE, שטפו את הדגימות שוב. לאחר מכן, השביו את החרוזים על ידי הוספה של 125 microliters של assay, wash, buffer, וניעור למשך שתי דקות לפני קריאת הפלטה.

הכנס את הדגימה לקורא הבדיקה בתוך 10 דקות מהשעיית החרוצים; החרוצים עוברים אחד אחד דרך גלאי שבו הם נחשפים לשני לייזרים. לייזר אחד מעורר את הצבעים הפנימיים המזהים את סט הצבעים של החרוצים, והשני מעורר את צבע הדגמי של FICO erything. עוצמת הפלואורסצנציה של FICO erything עבור מספר קבוע מראש של חרוצים מדווחת כ-FM FI. קרא את הבאר הראשונה כדי לוודא שפאנל החרוצים שנבחר תואם לפרופיל החרוצים בבארי הבדיקה.

אם חרוצים נופלים מחוץ לאזור החרוצים המוקצב להם בתצוגת הפרוטוקול, סימן שנבחר פרופיל שגוי. חרוצים שעברו רספנסיה (resuspension) תקינה ימלאו את האזורים המוגדרים להם כפי שמופיע בתוכנת קורא הבדיקה. אם החרוצים מצומקים (aggregated), הם ימלאו את האזורים שלהם בקצב איטי.

ניתן להוציא את פלטת הבדיקה מהקורא ולערבב ידנית את הבארות כדי להפריד את החרוזיים. הוצא את פלטת הבדיקה מהקורא ובעזרת פיפט רב-ערוצי בצע שאיבה ויריקה (triturate) בכל בארה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן, החזר את פלטת הבדיקה לקורא והמשך בבחינת התוצאות.

דווחו על שגיאות כגון ספירת חרוצים לא מספקת או ירידה במדדי ה-IgG anti IgG של החרוצים, וחזרו על הבדיקה עבור דגימות אלו. לאחר ייצוא הנתונים ל-Excel וחישוב ה-net MFI, קבעו האם ביקורות הבדיקה עמדו בדרישות, למעט סרום חיסוני בטווח גבוה. ביקורות שנכשלו אינן קבילות ויש לחזור על הבדיקה.

טבלה זו מציגה נתונים עבור סרום לבדיקה ובקרות בדיקה מלוח בדיקה טיפוסי. כל בקרות ה-IgG עברו. תוצאות הבדיקה עבור לוח זה מצביעות על כך שדגימות רבות של תגובתיות לרקמה ובקרות IgG נכשלו, כפי שניתן לראות בבארים הכתומות.

A1C one ו-F1 מצביעים על כשל בתגובתיות רקמת ה-TC, כאשר ציון ה-TC מופיע בסוגריים; Wells B one ו-E one ממחישים את שני סוגי הכשלים בבקרת הפנים של IgG, בהתאמה: חוסר בנוגדני בדיקה או בריאגנטים של הבדיקה, BAG או SPE. תוצאות לוח הבדיקה יפורשו רק אם בקרת התאמת המערכת ובקרת הסרום עומדות בקריטריוני הקבלה המוצגים כאן. מיקרוספירות מצופות בנוגדנים ספציפיים למין נגד אימונוגלובולין של סרום בדיקה עלולות להראות ציונים נכשלים עקב הוספת דגימה לא מספקת, דילול דגימה גבוה מדי, מין שגוי, או בדיקת סרום ממארח עם חסר חיסוני.

אם תוצאות הבקרות של בדיקת הניסוי מספקות, ציוני הבדיקות האינדיבידואליים מסווגים בהתאם להנחיות הבאות. לאחר ביצוע הליך זה, עלינו להשתמש בשיטות נוספות כגון Eliza, IFA, ו/או Western blot כדי לאשר ממצאים ראשוניים חיוביים או בלתי צפויים. חיוני לאמת תוצאות אלו לפני קבלת כל החלטה בנוגע לניהול בעלי החיים.

ניתן לבצע זאת באמצעות שימוש במתודולוגיות שונות על אותה דגימה או על דגימות נוספות מאותה מושבה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ה-multiplex fluoro, metric immunoassay, וכיצד לפרש את התוצאות המתקבלות במעבדתכם. דבר זה יאפשר לכם לצמצם את כמות העבודה תוך איסוף מידע רב יותר מכל באר של דגימת בדיקה.