בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging
23 ביולי 2008
סרט הווידאו הזה מדגים כיצד ההתנהגות בידול במבחנה של תאים עובריים בעכבר לגופים embryoid בשיטת ירידה תלוי.
לתאי גזע יש פוטנציאל יוצא דופן להתפתח לסוגים רבים ושונים של תאים בגוף, ובכך הם משמשים כמעין מערכת תיקון עבור הגוף. מבחינה תיאורטית, הם יכולים להתחלק ללא הגבלה כדי להשלים תאים אחרים.
כאשר תא גזע מתחלק, לכל תא חדש יש את הפוטנציאל להישאר תא גזע או להפוך לסוג תא אחר בעל תפקוד מומחה יותר. תחום מבטיח זה במדע מוביל מדענים לבחון את האפשרות של טיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות in vitro. התמיינות של תאי גזע עובריים מתרחשת כאשר התאים מאפשרים להצטבר בתרבית סספנסיה.
בהיעדר תאי מאכילה של פיברובלסטים עובריים של עכבר וגורם מעכב לוקמיה (leukemia inhibitory factor), צבירי תאים אלו נקראים גופי עובר (embryo bodies). שיטת הטיפה התלויה היא הליך יעיל להביאה של תאי גזע לדיפרנציאציה לגופי עובר in vitro. שלום, אני Sha Juan מהמחלקה לרפואה קרדיווסקולרית באוניברסיטת סטנפורד.
היום נדגים בפניכם פרוצדורה להגבשה אינדיבידואלית של תאי גזע עובריים לגומי גופים עובריים באמצעות שיטת הטיפה הידנית. אנו משתמשים בדרך כלל בשיטה זו כדי להבדיל תאי גזע עובריים לתאי שריר לב (cardiomyocytes). פרוצדורה זו כוללת את השלבים הבאים: הכנת סספנסיה של תאי גזע עובריים בתאים בודדים, יצירת תרביות בטיפה ידנית, העברת תרביות טיפה ידנית לצלחות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד, וזריעת הגופים העובריים על צלחות מצופותהה ג'לטין.
ובכן, נתחיל. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא הכנת תרחיף תאים בודדים של תאי גזע עובריים. מכיוון שאנו מתרבלים את תאי הגזע העובריים הבלתי מובחנים על ידי גידולם על פיברובלסטים עובריים של עכבר, עלינו לנתק את התאים ולהפרידם מהפיברובלסטים.
כדי לבצע זאת, אנו מבצעים טריפסיזציה לתאים באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות. לאחר השלמת הטיפול בטריפסין, הוסף מצע גידול לתאי גזע עובריים של עכבר כדי לנטרל את הטריפסין. לאחר מכן, העבר את תרחיף התאים למבחנה קונית של 15 mil.
לאחר מכן, פריסו את מושבות התאים על ידי פיפטינג (pipetting) מעלה ומטה כנגד תחתית המבחנה, עד לקבלת סספנזיה דקה של תאים ללא גושים נראים לעין. כעת, סובב את התאים ב-1000 RPM למשך חמש דקות. לאחר הסבב, שאבו את הסופרנאט ותלו את התאים ב-10 mils של מצע גידול לתאי ES של עכבר.
העבירו את תרחיף התאים לבקבוק T 75 מצופה מראש ב-0.1% gelatin והדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות עם 5%CO2 למשך שעה אחת. לאחר שעה, הפיברובלסטים ייצמדו לפני השטח של הבקבוק, אך התאי הגזע יישארו במצע. שאבו את המצע בעזרת פפיטה כדי לאסוף את התאי הגזע.
סבבו את התאים ב-1000 RPM למשך חמש דקות ושאבו את המדיום. לאחר מכן, הוסיפו 10 ml נוספים של מדיום דיפרנציאציה, וסבבו מחדש את התאים באמצעות פיפוט חוזר עד לקבלת תרחיף תאים דק. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
כעת אנו מוכנים לתרבית של תרחיף התאים בשיטת הטיפה התלויה. כדי להתחיל בתרבית הטיפה התלויה, השתמש במדיום דיפרנציאציה כדי לדלל את תרחיף תאי הגזע לריכוז של 500 תאים ל-20 µL. לאחר מכן, הפוך את המכסה של צלחת תרבית רקמה בנפח 150 מילימטר.
לאחר מכן, העבירו בפיפט 20 µL של תגסוס התאים אל פני השטח הפנימיים של מכסה הפלטה. באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 10 mL של PBS אל הפלטה. הפכו במהירות את מכסה הפלטה והניחו אותו בעדינות על הפלטה כדי ליצור טיפות תלויות.
לאחר שהמכסה של הפלטה במקומו, העבירו בזהירות את הפלטה לתרבית באינקובטור. השאירו את התאים ללא הפרעה למשך יומיים. עם סיום האינקובציה, נמשיך בהעברת תרבית הטיפה התלויה (hanging drop) לפלטות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment).
לאחר יומיים, הפכו בזהירות את מכסה הפלטה, שאבו 180 microliters של מצע התמיינות טרי, וטפטפו מספר טיפות לתוך פלטת 96 בארות בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment). לאחר מכן, שאבו את הטיפות באמצעות פיפטה והעבירו אותן אחת אחת לפלטת ה-96 בארות. הכניסו את הפלטות לאינקובטור והשאירו אותן ללא הפרעה למשך שלושה ימים.
גופי העוברים ימשיכו לגדול לצורת כדור. עם השלמת הדגירה, נהיה מוכנים לזריעת גופי העוברים, וזאת כדי לסייע לגופי העוברים להמשיך להתרבד.
אנו מעבירים אותם לצלחת בעלת 48 בארות המצופה בג'לטין. לשם כך, תחילה נצפה כל באר בצלחת ב-300 µL של ג'לטין בריכוז 0.1%. לאחר הוספת הג'לטין, יש להדגיר את הצלחת למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.
ביום למחרת, שאבו את הג'לטין מלוח ה-48 בארות. לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של מצע דיפרנציאציה לכל בארה. כעת, העבירו אחד אחד את גופי העובריים מהלוח בעל 96 הבארות אל הפלטות בעלות 48 הבארות המצופות בג'לטין.
בדרך כלל אנו מחליפים את המצע למחרת ולאחר מכן בכל יום שני כדי לשמר את התאים. אנו משתמשים בשיטה זו כדי לחפש פרוטוקולים טובים יותר להגבלה של תאי גזע עובריים. עבור תאי השריר של הלב (cardiomyocytes), הראינו לכם כעת כיצד לבצע גבירה in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר באמצעות תרביות של טיפות תלויות (hanging drop cultures).
שיטה זו יעילה מכיוון שהתחתית העגולה של טיפת התלייה מאפשרת את התקבצות תאי גזע עובריים, ובכך מספקת סביבה טובה להיווצרות גופי עובריים (Embry bodies). בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי ניתן לשלוט במספר תאי הגזע העובריים המתקבצים בטיפת התלייה על ידי שינוי מספר התאים בתרחיף התאים הראשוני. זהו כל הפרוצדורה.
תודה לצפייה. בהצלחה בניסוי שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים בידול in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר לגופי עובריים (embryoid bodies) באמצעות שיטת טיפת התלייה (hanging drop method). לתאי גזע יש פוטנציאל להתפתח לסוגים שונים של תאים, והם משמשים כמערכת תיקון עבור הגוף.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- דיפרנציאציה של תאים
- טכניקות תרבית in vitro
רקע
- תאי גזע יכולים, תיאורטית, להתחלק ללא הגבלה.
- כל תא חדש יכול להישאר תא גזע או להפוך לתא מותמחה.
- תחום זה במדע מוביל לפיתוח פוטנציאלי של טיפולים מבוססי תאים.
- דיפרנציאציה של תאי גזע עובריים מתרחשת בתרבית סוספנסיה.
מטרת המחקר
- להדגים את הדיפרנציאציה של תאי גזע עובריים.
- להציג את שיטת הטיפה התלויה (hanging drop) עבור אגרגציה של תאים.
- לספק תובנות לגבי יישומים טיפוליים פוטנציאליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיפרנציאציה in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר.
- שיטת הטיפה התלויה (Hanging drop) לאגרגציה של תאים.
- טכניקות לתרבית תאים בסספנסיה.
- תצפית על היווצרות גופי גזירה (embryoid bodies).
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של גופים עובריים (embryoid bodies) מתאי גזע.
- הדגמת יעילותה של שיטת הטיפה התלויה (hanging drop).
- תובנות לגבי תהליך הדיפרנציאציה של תאי גזע.
- השלכות פוטנציאליות לטיפולים מבוססי תאים.
מסקנות
- שיטת הטיפה התלויה יעילה עבור דיפרנציאציה של תאי גזע.
- ניתן להוות גופי Embryoid in vitro מתאי גזע עובריים של עכבר.
- טכניקה זו עשויה לקדם את המחקר ברפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
יצירה מבוקרת של גופי Embryoid מאפשרת דיפרנציאציה הדירה וניתנת לשחזור in vitro של תאי גזע עובריים של עכבר, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקר של רפואה רגנרטיבית. שיטת טיפת התלייה (hanging drop method) מספקת גישה סטנדרטית וניתנת להרחבה ליצירת אגרגטים רב-תאיים הומוגניים, ובכך מפחיתה את השונות בסריקות פנוטיפיות ובפיתוח בדיקות בשלבים הבאים. טכניקה זו מגבירה את מידת הביטחון בניבוי על ידי מתן אפשרות לבקרה מדויקת על מספר התאים, מה שמקל על יצירת גופי Embryoid עקביים לצורך בדיקת היפותזות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי התמיינות של תאי גזע ותיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות יצירה מבוקרת של גופי אמבריואיד.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מערכת הניתנת לשחזור להערכת מחויבות לשושלת תאים ומסמני התמיינות מוקדמים.
- ערך חיזוי: משפר את תעדוף הפורטפוליו על ידי מתן אפשרות להערכה סטנדרטית של יעילות ההתמיינות תחת הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של מערכות גופי עובר (embryoid body) מתוקפות לצורך סריקת תרכובות והערכה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ושלב שחזור של הבדיקה באמצעות אגרגציה מבוקרת של תאים בטיפות תלויות (hanging drops).
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה והערכה עקבית של תרכובות על פני בארות ולוחיות מרובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי יצירת גופים עובריים (embryoid bodies) המדמים תהליכי התפתחות מוקדמים הרלוונטיים לטיפולים רגנרטיביים.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות ייצור סטנדרטי של גופים עובריים.
- הפחתת סיכונים: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של קינטיקת הדיפרנציאציה וההומוגניות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטת הטיפה התלויה משתלבת ברצף הגילוי, החל משלבים מוקדמים של בידול תאי גזע, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מאפשרת יצירה סטנדרטית של גופי Embryoid לצורך סריקה טיפולית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי אפשור אגרגציה מבוקרת של תאי גזע עובריים של עכבר לגופי עובריים (embryoid bodies).
- סינון: מספקת מוכנות למבחנים ויכולת שחזור באמצעות יצירה אחידה של גופי עובריים, ובכך מקלה על השגת תוצאות אמינות בסריקת תרכובות.
- אנליזה: מספקת פלטים כמותיים כגון גודל, מספר ומורפולוגיה של גופי עובריים לצורך השוואת תנאי дифפרנציאציה.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי יצירת גופי עובריים רלוונטיים למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים ומחקרי התאמה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כבסיס בר-שימוש חוזר בפנייה לפרויקטים הדורשים ייצור סטנדרטי של גופי עובריים עבור מבחני дифפרנציאציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתוצאות דיפרנציאציה, תיקוף מטרות והפחתת עמימות מכניסטית במחקר תאי גזע.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של יצירת גופי אמבריואידים במעבדות ובניסויים שונים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בקווי פיתוח של רפואה רגנרטיבית.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על איכות עקבית של גופי אמבריואידים ויעילות דיפרנציאציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי גזע, הכנת תרחיף תאים בודדים וטיפול בגופי Embryoid.
- תלוי בגישה לצלחות בעלות הידבקות נמוכה (low-attachment plates), משטחים מצופים בג'לטין ומדיות התמיינות סטנדרטיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ריכוז התאים, נפח הטיפה וזמני הדגירה להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת גופי Embryoid למשטחי תרבית שונים לצורך התמיינות המשך.
- מוגבל על ידי הצורך בדיוק בפיפטאציה ידנית ובטיפול זהיר למניעת פגיעה בגופי ה-Embryoid במהלך שלבי ההעברה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Introduction
2:06
Preparing Single Cell Suspension of Embryonic Stem Cells
3:46
Generating Hanging Drop Cultures
4:39
Transferring Hanging Drops to Ultralow Attachment Plates
5:17
Plating Embryoid Bodies onto Gelatin- Coated Plates
6:12
Conclusion
