בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע
9 ביוני 2012
פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגרום להסתה (differentiation) של תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים מוטוריים. ראשית, תרב תאי גזע עובריים של עכבר על פיברובלסטים עובריים ראשוניים של עכבר, והוסף leukemia inhibitory factor כתוסף. לאחר מכן, הגבר את תהליך הנורמליזציה על ידי הוספת noggin, BFG F ו-FGF eight; השר את ההתמיינות לנוירונים מוטוריים באמצעות דגירה עם retinoic acid ו-smoothened agonist, ולאחר מכן בצע התארכות של האקסונים והבשלת הנוירונים המוטוריים.
לבסוף, השתמשו במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי לבחון תאי MES מובחנים המבטאים פלואורסצנציית GFP חזקה. ייצור כמויות גדולות של נוירונים מוטוריים הקל על המחקר של מחלות נוירונים מוטוריים בהשוואה לפרוטוקולים קיימים כיום. גישה זו של בידול תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים מוטוריים היא יעילה יותר. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ניוון שרירים ספינלי.
ניתן ליישם זאת גם למחלות נוירונים מוטוריים אחרות, כגון סקלרוזיס צידית שרירית (amyotrophic lateral sclerosis). כדי לזרוע פיברובלסטים עובריים ראשוניים של עכבר, יש לצפות ארבעה צלחות לתרבית רקמות של 100 מילימטר בשמונה מיליליטר של תמיסת ג'לטין 0.1%. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, יש להסיר את עודפי הנוזל. כעת, יש לדלל מבחנה אחת של mitomycin C ב-PMEF מופעל בתוך 40 מיליליטר של מצע PMEF, לזרוע בארבע הצלחות ולתרבת למשך עד שבוע.
בשלב הבא, הפשיר מבחנה אחת של תאי MES באמבט מים של 37 °C. שטוף את התאים עם 5 mL של מצע E ES במבחנה של 15 mL. לאחר מכן, סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 800 RPM למשך חמש דקות.
שאבו את העלייה (supernatant) והשביו מחדש את תאי ה-MES ב-20 milliliters של מצע ES עם leukemia inhibitory factor שנוסף טרי. המשיכו בהסרה של 10 milliliters מצע מתרביות ה-PMEF והחליפו אותם ב-10 milliliters של ת сусפנסיית תאי ה-HBG three ES. עקבו אחר התקדמות תאי ה-MES לאורך זמן, ממושבות קטנות לאחר 24 שעות ועד למושבות שקוטרן כ-100 micrometers לאחר 72 שעות מהזריעה.
יש להחליף את המצע מדי יום כדי לשמור על השגחת התאים לצורך השראת תאי MES. התמיינות לנוירונים מוטוריים. יש להפריד תחילה את תאי הגזע העובריים של העכבר מתאי המזינים מסוג PMEF ולאחר מכן לגדלם בסביבת תליה ביום ההשראה.
עבור כל תרבית ES של 100 millimeter, הכין מבחנה מסוג T one 50 מצופה ב-0.1% gelatin. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את ה-gelatin העודף ושטוף שלוש פעמים עם PBS. המשך לשאיבה זהירה של המצע מתרבית ה-ES, תוך הקפדה לא להסיר מושבות שאינן קשורות היטב. לאחר מכן, שטוף פעם אחת עם 10 milliliters PBS.
כעת, כדי להפריד את תאי ה-MES מתאי ה-PMEF, הוסיפו שלושה מיליליטר של 0.25%trypsin EDTA והדגירו למשך שלוש עד חמש דקות. בטמפרטורה של 37 °C, ודאו שתאי הגזע ותאי ה-PMEF נגמרו מהפלטה. לאחר מכן, הוסיפו 15 מיליליטר של מצע ES טרי ופצלו את המושבות באמצעות פיפטינג.
העבירו את תרחיף התאים לתוך בקבוק T one 50 שהוכשר בציפוי ג'לטין והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר ל-PFS להיצמד למשטח המג'לטין. כעת, אספו את תאי ה-MES הצפים לשפופרת של 50 milliliter והשקיעו אותם באמצעות סנטריפוגציה. השביו את התאים ב-10 milliliters של מצע בידול עצבי.
יש לספור את התאים במדיום באמצעות המוסיטומטר ולאחר מכן לזרוע אותם בצלחת תרבית למבזקה של 100 מילימטר לצורך גבייה. ביום הראשון, יש לוודא באמצעות מיקרוסקופיה שתאי ה-MES יצרו אגרגטים צפים קטנים הנקראים גופי עובר. מכיוון שכל שארית של PMEF נצמדת לצלחת, יש להעביר את תאי ה-ES התלויים ואת המדיום למבחנה של 15 מיליליטר, ולאחר מכן לסבב בצנטריפוגה במהירות של 500 RPM למשך שלוש דקות.
כדי לאסוף את הגופי העובריים, שאבו את המצע בזהירות, הוסיפו 10 milliliters של מצע התמיינות עצבית טרי לגופי העובריים (EBS) השקועים, ולאחר מכן זרעו את התאים בצלחת תרבית בקטריאלית חדשה למשך 24 שעות תחת תנאי התמיינות. ביום השני, סובבו את צלחת התרבית והעבירו את המצע ואת ה-EBS לשפופרת של 15 milliliter. הניחו ל-EBS לשקוע בכוח הכבידה, לאחר מכן שאבו את המצע בזהירות והשביו את ה-EBS למצב של סספנסיה ב-10 milliliters של מצע התמיינות לנוירונים מוטוריים.
תרבלו את ה-EBS במצע גידול בצלחית בקטריאלית חדשה למשך חמישה ימים במהלך הבידול. ביום השביעי, ודאו כי ה-EBS הם בקוטר של כ-150 עד 200 micrometers ומבטאים אותות GFP חזקים בעת הבידול. ביום החמישי, יומיים לפני פירוק ה-EBS, הניחו כיסויי זכוכית עגולים בקוטר 12 millimeter בתחתית של פלטה בעלת 24 בארות.
לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters של poly DL ornithine בריכוז 100 micrograms per milliliter, והדגירו בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius למשך לילה. שאבו את ה-poly DL ornithine והייבשו את הפלטות ואת כיסויי הזכוכית באוויר בתוך מנדף לתרבית רקמות. שטפו את בארי הפלטה במים מזוקקים פעמיים (double distilled water) שלוש פעמים.
יש להניח לייבש באוויר כדי לצפות את לביבות הכיסוי. הכין דילול טרי של 2 µg/mL של laminin מעכבר ב-5 mL של 1X PBS קר מאוד. הוסף 0.5 mL לכל באר והדגר בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה.
שטפו פעמיים ב-PBS בעת הדיפרנציאציה. ביום השביעי, אספו את ה-EBS לשפופרת של 15 מיליליטר והניחו ל-EBS לשקוע בכוח הכבידה. לאחר ארבעה שטיפות ב-PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של ACU max ל-EBS, ערבבו בעדינות והדגרימו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאבו את עודפי ה-ACU max המכסים את ה-EBS.
כעת הוסיפו 3 mL של מצע MND ובצעו דיסוציאציה של ה-EBS על ידי פיפוט כ-20 פעמים באמצעות מיקרו-פיפט של 1 mL, לאחר מכן דגרו למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, והעבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים (cell strainer cap) אל תוך מבחנה של 12x75 mm. חזרו על שלב דיסוציאציה זה עם הגושים והתאים שנותרו במסנן כדי להגדיל את תלוי התאים הבודדים בתרחיף סופי של תאים בודדים בנפח של 6 mL. ערבבו בעדינות את תרחיף התאים הבודדים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר; דללו את התאים במצע MND מלא לצפיפות של 2×10⁵ תאים למשםל (cells/mL) לפני הזריעה בצלחת.
0.5 milliliters של תגסוס תאים לכל באער בלוחות 24 באערים שהוכנו ומכילים לבישות (cover slips) מצופות ב-poly DL ornithine laminin. התאים המובחנים מקימים נוריטים ארוכים לאחר יומיים. בתרבית, HBG three הוא קו תאי ES שנגזר מעכבר טרנסגני המבטא EGFP תחת בקרתו של פרומוטור ספציפי לנוירונים מוטוריים HB nine, עם פרוטוקול בידול מוגדר.
ניתן להשתמש בתאי MES לגזירת נוירונים מוטוריים. תאי MES שאינם מובחנים יוצרים מושבות עגולות על גבי שכבת הזנה של פיברובלסטים. הם מראים ביטוי חלש של GFP.
תאי MES אלו הופרדו משכבות מזינות (feeder layers) ותורבדו בצלחות בעלות היצמדות נמוכה להיווצרות גופי עוברים (embryonic bodies). תאי MES מודלפים ביטאו פלואורסצנציית GFP חזקה לאחר היום השביעי. גופי עוברים (EBS) מודלפים פורקו והועברו לצלחות מצופות poly DL ornithine laminin.
התאים המובחנים מקימים נוריטים ארוכים מגופי התאים של התאים שהוחדרו לאחר יומיים בתרבית, וניתן לאפיין את הנוירונים המוטוריים הגזורים מתאי MES באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. תאים אלו, החיוביים ל-GFP, מבטאים את הסמן הפאן-נוירונלי neurofilament ושני סמנים ספציפיים לנוירונים מוטוריים: Eyelid one ו-choline acetyl transferase. צביעת DPI מסמנת את הגרעינים בשילוב עם אלו.
פרוטוקול הגזירה בשני שלבים שלנו מספק דרך יעילה לגזור תאי MES לנוירונים מוטוריים של חוט השדרה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה לגבי האופן שבו ניתן לגזור ביעילות תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים מוטוריים. לסיכום, זכרו כי איכות גבוהה של תאי גזע עובריים של עכבר היא הפרמטר הקריטי ביותר ליצירה יעילה של נוירונים מוטוריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול חדש להבחנה יעילה של תאי גזע עובריים של עכבר לנוירוני מוטוריקה. התאים המובחנים מראים מאפיינים של נוירוני מוטוריקה, אשר אושרו על ידי ביטוי של סממנים ספציפיים באמצעות טכניקות של אימונוהיסטוכימיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- מחקר על נוירונים מוטוריים
רקע
- מחלות של תאי עצב מוטוריים מציבות אתגרים משמעותיים במחקר.
- פרוטוקולים נוכחיים להגבהה (דיפרנציאציה) הם לעיתים קרובות לא יעילים.
- שיפור שיטות ההגבהה יכול לשפר את תוצאות המחקר.
- תאי גזע עובריים של עכבר מהווים מודל בעל ערך לחקר תאי עצב מוטוריים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול יעיל יותר להגזת תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים מוטוריים.
- הסייעת למחקר על מחלות של נוירונים מוטוריים.
- מתן תובנות לגבי מצבים כגון ניוון שרירים ספנל.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של תאי גזע עובריים של עכבר על פיברובלסטים עובריים ראשוניים של עכבר.
- הוספת גורם עיכוב לוקמיה (leukemia inhibitory factor) לתרביות.
- הוספת noggin, BFGF ו-FGF8 להשראת התמיינות של נוירונים מוטוריים.
- שימוש בחומצה רטינואיטית וב-smoothened agonist להבשלה ולהארכת אקסונים.
תוצאות עיקריות
- דיפרנציאציה מוצלחת של תאי גזע עובריים לנוירונים מוטוריים.
- אישור ביטוי של סממנים לנוירונים מוטוריים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
- הפקה של כמויות גדולות של נוירונים מוטוריים למטרות מחקר.
- יעילות משופרת בהשוואה לפרוטוקולים קיימים.
מסקנות
- הפרוטוקול החדש משפר באופן משמעותי את תהליך הדיפרנציאציה.
- שיטה זו יכולה לקדם את ההבנה של מחלות נוירונים מוטוריים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בפרוטוקול זה להשגת תובנות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דיפרנציאציה יעילה של תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים מוטוריים פותרת צוואר בקבוק קריטי במידול מחלות ובגילוי תרופות מוקדם עבור הפרעות נוירודגנרטיביות. פרוטוקול זה מגביר את הביטחון החזוי ביצירת סוגי תאים הרלוונטיים למחלה, ובכך תומך במחקר תרגומי ובתיקוף מטרות עבור מחלות נוירונים מוטוריים כגון SMA ו-ALS. שיפור ביעילות הדיפרנציאציה מאפשר ייצור רחב של נוירונים מוטוריים תפקודיים, ובכך מקל על סריקה פנוטיפית חסונה והסרת סיכונים מכניסטיים בקווי מחקר פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר יצירה של נוירונים מוטוריים הרלוונטיים למחלה לצורך בחינה ממוקדת של מטרות המבוססת על היפותזות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות מועמדות במערכת מבוקרת המופקת מתאי גזע.
- משפר את הפחתת הסיכונים המכניסטיים על ידי אספקת תוצרי דיפרנציאציה עצבית הניתנים לשחזור.
- מקל על תעדוף הפורטפוליו על ידי מתן אפשרות להערכה בשלב מוקדם של נוירוטוקסיות ויעילות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מקור סטנדרטי של נוירונים מוטוריים לסריקת פנוטיפ בעלת תוכן גבוה.
- מאפשר פיתוח של בדיקות כמותיות באמצעות קריאות של GFP וסמנים אימונופלואורסצנטיים.
- תומך בחזרתיות ובמדרגיות עבור תהליכי עבודה של הערכת תרכובות.
- מכין מערכות תאים עובות לסריקות המשך ולמחקרים מכניסטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מודלים של מחלות in vitro עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים להפרעות של תאי עצב מוטוריים.
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות שימוש בנוירונים בעלי אפיון תפקודי.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת נתונים חסונים ורלוונטיים למחלה.
- משפר את הערך הניבוי לבחירת מועמדים טיפוליים במסלולי פיתוח למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול דיפרנציאציה דו-שלבי זה משתלב ברצף המוקדם של שלבי הגילוי ועד למשלב הפרה-קליני, ומאפשר יצירה אמינה של נוירונים מוטורים לצורך תיקוף מטרות, סריקה ומחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים במודלים של מחלות נוירונים מוטוריים.
- סריקה: מספק נוירונים מוטוריים מוכנים לבדיקה ומאומתים באמצעות סמנים, לצורך בדיקה רפרודוקטיבילית של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים באמצעות ביטוי GFP וניתוח סמנים אימונופלואורסצנטיים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים באמצעות מערכות תאים הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר ליצירת נוירונים מוטוריים לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דיפרנציאציה לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך התקדמות (go/no-go) וניהול יעיל של הון בתיק הפיתוח.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים לטיפולים נוירותרפויטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי גזע ובפרוטוקולים של התמיינות עצבית.
- נדרשת גישה לתשתיות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וצביעה אימונוהיסטוכימית לאישור סממנים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות של יעילות ההתמיינות.
- עשוי לדרוש התאמה עבור קווי תאי גזע שונים או מודלים של מחלות.
- תלוי באוכלוסיות תאי גזע התחלתיות באיכות גבוהה להשגת תוצאות אופטימליות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Culturing Mouse Embryonic Stem Cells (Timing: 3 days)
2:34
Neural Induction (Timing: 2 days)
4:48
Motor Neuron Specification (Timing: 5 days)
5:24
Preparation of Poly-DL-Ornithine/Laminin Coated Coverslips (Timing: 2 days)
6:18
Axon Elongation (Timing: 2 days)
7:47
Results: mES Cell Differentiation into Motor Neurons
9:12
Conclusion
