הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

C. elegans הוא אורגניזם מודל שימושי ביותר, הן בשל הידיעות שלנו על שושלות התאים שלו והן בשל עושר המידע שהופק מרצף וניתוח הגנום המלא שלו. בסרטון זה, נדגים את תהליך ההזרקה המיקרוסקופית של פלסמידים לתוך C. elegans וברירה של צאצאים טרנסגניים באמצעות מיקרוסקופיה פלורסצנטית; מכיוון ש-C. elegans הוא בעל חיים שקוף ורב-תאי, הוא אידיאלי להדמיה של גנים טרנסגניים המבטאים חלבונים מסומנים פלורסצנטית in vivo. שלום, שמי לורה ברקוביץ ואני עובדת מחקר במעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה כאן באוניברסיטת אלבמה.

ואני אדם נייט, גם אני מהמעבדה של קלוול באוניברסיטת אלבמה. היום אראה לכם כיצד להתכונן ולבצע מיקרו-הזרקה של פלסמידים כדי ליצור זני *C. elegans* טרנסגניים, ואראה לכם כיצד לבחור ולשמר שושלות של *C. elegans* טרנסגניות. אז בואו נתחיל.

לפני שנתחיל בהזרקה המיקרוסקופית, ישנם מספר שלבי הכנה שאדגים לכם כעת. ראשית, הכינו את ה-plasmid DNA להזרקה; נדרשים שני פלסמידים, אחד המקודד לביטוי ספציפי לרקמה של הגן הנחקר, והשני המספק סמן בחירה לטרנספורמציה. ערבבו את הפלסמידים יחד ביחס של אחד לאחד בריכוז של 50 ng/µL.

בשלב הבא, הכינו רפידות קיבוע (auger pads), אשר ישמשו להצמדת התולעים לצורך הזרקה. להכנת רפידות הקיבוע, הניחו תחילה מספר זכוכיות כיסוי בגודל 22 על 50 מילימטר על משטח העבודה. באמצעות פיפט פסטור, טפטפו טיפה של 2% agros מומס על זכוכית כיסוי אחת, והניחו מיד זכוכית כיסוי שנייה מעל הטיפה בזווית של 90 מעלות לראשונה.

המתינו מספר שניות עד שהאירוג'ל יתמצב, ולאחר מכן הסירו את זכוכית הכיסוי העליונה. קוטרה של דיסקיט האירוג'ל השטוח צריך להיות בין 15 ל-20 מילימטרים. כפי שנעשה עם דגימות דומות, הניחו לפדית האירוג'ל להתייבש באוויר באופן מלא במשך מספר שעות או במהלך הלילה.

לאחר שהם יבשים, אחסנו את הרפידות בקופסת זכוכית לכיסויים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את טועני המחטים עבור תמיסת ה-DNA. לשם כך, קחו צינור נימי של 100 µL וחממו אותו במרכזו בלהבה פתוחה, ומשכו אותו במהירות עד למשך של פי שניים בקירוב מאורכו המקורי.

לאחר שהצינור הנימי מתקרר, יש לשבור את שני החצאים. יש להכין מלאי של 10 עד 20 טעוני מחט להזרקה. ניתן לאחסן אותם במצב אנכי בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה.

בראק, היזהר. קצות טוען המחטים חדים מאוד. כעת הכן את מחטי המיקרו-הזרקה.

מחטים אלו עשויות מצינור קפילרי מיוחד המכיל פילמנט זכוכית פנימי. פילמנט זה משמש כפתיל עבור תמיסת ה-DNA. כדי להכין את המחטים, אנו משתמשים ב-Niki PP eight 30 Polar עם הגדרת חום של 24.8; מספר מחטים נמשכות בבת אחת לצורך אחסון.

ניתן להרכיב מספר מחטים על פס של חימר למניפולציה. רסיסים קטנים של זכוכית כיסוי ישמשו לשבירת קצה המחט שנמתחה. רסיסים אלו מכינים על ידי עטיפת זכוכית כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר ב-Kim wipe והפעלת לחץ עדין עד שהיא נשברת למספר חלקים.

השתמשו ברסיסים שגודלם כ-שלושה על ארבעה מילימטרים. בנוסף להכנת ה-DNA והמחטים, הכינו כ-50 עד 100 תולעים בשלב התפתחותי מתאים. שתי תולעים מסוג wild type עבור כל מבנה של וקטור ביטוי שיוזרק.

אנו מוכנים כעת להגדיר את מיקרוסקופ ההזרקה המיקרוסקופית. כדי להתחיל בהגדרת המיקרוסקופ, פתחו את השסתום הראשי במכל ההליום המחובר לזרוע ומחזיק מחטי ההזרקה המיקרוסקופית. סגרו את הווסת כדי לאפשר לגז להיכנס לקו.

בעת הגעה ללחץ של 35 PSI ניתן לשחרר את הגז באמצעות דוושה. לאחר מכן, הכנסו מטען מחט לתוך צינורית של פיפטור פה סטנדרטי וטפטפו כמות קטנה של תערובת הפלסמיד, כ-1 µL. כעת, הכניסו בעדינות את המטען לכל אורכה דרך מחט המיקרו-הזרקה עד להרגשת התנגדות.

הוציאו את תמיסת ה-DNA על ידי נשיפה עדינה, ולאחר מכן הסירו את המטען. לאחר טעינת ה-DNA, הכניסו את המחט לזרוע המיקרו-הזרקה, תוך הקפדה למקם אותה בתוך אטם הגומי הפנימי הקטן, ולאחר מכן הצמידו אותה לזרוע המניפולטור. לאחר מכן, הניחו רסיס זכוכית כיסוי לשבירת מחטים על קצה אחד של מדבקת תמיכה (auger pad).

כסה את הרסיס ואת כל שטח הפנים של משטח ה-auger בשמן פחמן חלול. לאחר מכן, הנח את משטח ה-auger על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. לאחר שמשטח ה-auger במקומו, מקם את המחט במרכז שדה הראייה באמצעות עדשת Forex ותאורת שדה בהיר (bright field), אך אל תוריד אותה עדיין אל תוך השמן.

בשלב הבא, מקמו את הקצה הפנימי של רסיס זכוכית הכיסוי במרכז, ולאחר מכן התמקדו בו. הורידו את המחט אל תוך השמן, והביאו אותה לאותו מישור מיקוד של רסיס זכוכית הכיסוי. הגבירו את ההגדלה על ידי מעבר לעדשה 40 x, התמקדו שוב בקצה הרסיס ובמיקמו מחדש את חוד המחט במידת הצורך.

כעת יש לשבור את קצה מחט ההזרקה. דחפו בעדינות את המחט כנגד קצה רסיס זכוכית כיסוי, ובמקביל הפעילו פולס קצר של גז באמצעות דוושת הרגל. כך קצה המחט יישבר באופן מספק.

lors when droplets of liquid escape the end of the needle due to excessive liquid flow caused by an opening that is too large, this is undesirable שכן הדבר עלול להרוג את בעלי החיים. לאחר שהמחט מוכנה, נתחיל בהזרקה המיקרוסקופית. לאחר מכן, הסר את משטח הקיבוע (auger pad) מהבמה על ידי הרמת המחט למעלה.

אך אין לשנות את מיקום ציר X או Y. החליקו את הבמה החוצה ממתחת למחט. הסירו את פד הקידוח והניחו אותה תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

העבירו תולעת אל הפד שמתחת לפני השטח של השמן. אם התולעת מתפתלת,לטפו אותה בעדינות עד שתבוא במגע עם פד הבורג, התולעת הלחה אמורה להידבק לבורג היבש. הניחו במהירות את פד הבורג חזרה על הבמה, כאשר התולעת ממרכזת בשדה הראייה.

לאחר מכן, הרד את המחט לאותה מישור מיקוד של התולעת. העבר את המסננים במיקרוסקופ ההפוך לתאורת Hoffman. מסנן ניגודיות זה מאפשר להפוך את הפרטים המורפולוגיים של התולעת לנראים.

באמצעות עדשה אובייקטיבית בעוצמה של 40x, התמקדו במרכז החושי הגרגירי של השחלה (gonad) של התולעת, מתחת לדפוס הדבש של גרעיני הנבט. בחרו בכל שחלה הממוקמת בצד של התולעת הפונה אל המחט. כוונו בעדינות את מיקום המחט עד שגם הקצה שלה יהיה במיקוד.

החדירו בעדינות את המחט למרכז הגונד (gonad) והפעילו פולס קצר של לחץ גז כדי להוציא טיפה אחת או שתיים של DNA לתוך זרוע הגונד. עם תרגול רב ומיומנות, תוכלו להבחין בגל של נוזל המתפשט לאורך הגונד הדיסטלי. תוכלו לפגוע במרכז הגונד בכל פעם.

יש לזכור כי חשוב לעבוד במהירות בעת הזרקה לתולעת, כיוון שהיא עלולה להתייבש בקלות. באופן אידיאלי, התהליך כולו אמור להימשך פחות מדקה עד שתי דקות.

לאחר השלמת ההזרקה, הסירו את משטח המקדח מהבמה והניחו אותו תחת מיקרוסקופ דיסקציה. טפטפו מיקרוליטר אחד של M nine buffer ישירות על התולעת המוזרקת. פעולה זו עשויה לדרוש טבילה של קצה הפפיטה מתחת לפני השטח של ה-halo carb oil.

הבופר אמור להחזיר את הלחות לתולעת, ואז היא תצוף מעל פני משטח ה-aeros pad; העבירו את התולעת לצלחת רגילה באמצעות פיק לתולעים (worm pick). כעת אמסור את התולעים המוזרקות לאדם, והוא ידגים לנו את הבחירה והתחזוקה של קווים טרנסגניים. התולעים המוזרקות מועברות לצלחות של 60 מילימטר נפרדות המזריעות מצע טרי, וניתן להן להתרבות.

תולעים אלו מייצגות את דור ה-P zero. בדרך כלל, בעלי החיים המוזרקים מדגרים בטמפרטורה של 20 °C למשך יומיים עד שלושה ימים עד להופעת הצאצאים. לאחר הופעת הצאצאים, ניתן להתחיל בסינון של תולעים טרנסגניות.

הצאצאים מדור F1 נבחנים כדי לאתר עדות לסמן הטרנסגני. במקרה זה, הסמן הניתן לבחירה הוא פלואורסצנטי, ולכן ניתן לבצע סריקה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. כל בעל חיים מדור F1 הנושא את הסמן הפלואורסצנטי משוכפל בנפרד על צלחת חדשה.

ה-P zero המוזרק עשוי להוליד רק בין אחד לחמישה צאצאים פלואורסצנטיים מכלל ה-F1 שלו. יש לאפשר להרמפרודיטים של ה-F1 להתרבות ב-20 degrees במשך יומיים עד שלושה ימים עד להופעת הצאצאים. ברגע שדור ה-F two מוכן, בוחנים גם בו בעלי חיים טרנסגניים. בעלי חיים מדור ה-F two שירשו והביעו מרקר טרנסגני נחשבים לקו יציב.

יש להחזיק כל קו יציב עצמאי כקו נפרד של תולעים; יש להרבות כל קו על ידי העברת מספר בעלי חיים טרנסגניים לצלחת חדשה בכל דור. פעולה זו חייבת להתבצע באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. אם הסמן לבחירה הוא פלואורסצנטי, כדי לשלוט בשונות במספר העותקים של הגן, יש להקים לפחות שלושה קווים יציבים עצמאיים עבור כל קונסטרקט שהוזרק.

הראינו לכם כעת כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של סומסומני וקטורי ביטוי, כיצד לזהות את ה-elgan וכיצד לבחור קווים יציבים. זהו זה. תודה שצפיתם בהם ובהצלחה בניסוייכם.