Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי

שמי מריה ואני עובדת ב-Y Healthcare ב-NOS שבשוודיה. חלבונים על פני השטח של התא מעורבים לעיתים קרובות בתקשורת בין תאים לסביבתם, ולכן הם בעלי עניין מיוחד במחקר השואף להשיג תובנות רבות יותר על מחלות וכן על וריאציות ביולוגיות אחרות המושרות על ידי שינויים בסביבת התא. בסרטון זה אראה לכם פרוטוקול פשוט לסימון חלבונים על פני השטח של התא בשיטת side-eye dodge, ותוכלו להעשיר באופן חזותי חלבונים אלו, הנמצאים בריכוז נמוך, ללא הגברה פיזית, ולבחון את ההבדלים בין חלבונים אלו על פני השטח של התא באמצעות הטכנולוגיה.

אם מצאת טכנולוגיה זו מעניינת, ניתן למצוא מידע נוסף במדריך ה-2D. יתרה מכך, יש לנו נספח יישומים בנושא ספציפי זה שניתן להוריד מ-job. בפרוטוקול לסימון שטח הפנים של התא שמופיע למעלה, מסמנים את התאים בעודם שלמים. במהלך תהליך הסימון, לצבע תהיה גישה רק לחלבוני שטח הפנים של התא.

לאחר שלב הסימון, התאים מנותחים כדי לאמת סימון ספציפי של פני השטח של התא. דגימת הסימון פולטלה לחלבוני ממברנה וחלבונים ציטוזוליים. במקביל הוכנה דגימה שאינה פולטלית.

לצורך השוואה, ניתוח הפרקציונציה הזה אינו הכרחי, אך בוצע כאן רק כדי להראות שפרוטוקול פני השטח של התא הוא ספציפי לחלבונים בעלי קצבי קולטנים על פני השטח של התא. ביצענו גם את פרוטוקול הסימון הסטנדרטי של ETH ללא דיאטה המוצג להלן; התאים מולחקים לפני הסימון, ובדרך זו כל החלבונים התאיים נגישים לסימון. לאחר שלב הסימון, הדגימות עוברות אלקטרופורזה דו-ממדית (2D electrophoresis).

תאים דבקיים מופרדים באמצעות הליך לא אנזימטי כדי למנוע עיכול של חלבוני פני השטח של התאים המיועדים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במגרד גומי (rubber policeman), אך שימוש במדיום לפירוק תאים מסוג enzyme three הוא אפשרות נוספת. ספרו וחלקו את תרחיפי התאים למבחנות של חמישה עד 10 מיליון תאים למבחנה. לאחר מכן, התאים מרוכזים על ידי צנטריפוגה ונשטפים ב-H-P-S-S-P-H 7.4 כדי להסיר שאריות של מדיום תרבית התאים.

זיהום של המצע מחלבוני סרום ומרכיבים פלואורסצנטיים עלול להפריע לתיוג ולגילוי. תאים הגדלים בתליה מרוכזים ישירות למשקע ונשטפים לפני שלב התיוג לאחר השטיפה. משקע התאים מומס מחדש ב-200 µL של בופר תיוג קר בקרח המכיל HPSS pH 8.5 ואוריאה בריכוז 1M.

עבור תנאי סימון אופטימליים של חלבונים על פני השטח של התא, יש לבדוק תמיד את ה-pH. לפני הסימון, השתמשנו ב-600 pic mold side-eye עבור 10 מיליון תאי CHO. היחס האופטימלי בין ה-side-eye למספר התאים ישתנה בהתאם לסוג התא.

מכיוון שאיננו יודעים את ריכוזי החלבון המדויקים על פני השטח של התא, אופן קביעת התנאים האופטימליים לסימון חלבונים באמצעות side-eye מתואר במדריך העקרונות והשיטות של אלקטרופורזה דו-ממדית (2D electrophoresis). התאים מדגריים עם side eye D floor, minimal dice למשך 20 דקות בקרח ובחושך.

לאחר תגובת הסימון, הצבע שאינו פעיל מוכחש על ידי הוספה של 20 µL של ליזין בריכוז 10 mM. תאי הסימון נשטפים כעת פעמיים בבופר HPSS קר ב-pH 7.4 כדי להסיר את עודפי הצבע. באופן זה, לא יישאר צבע חופשי שיוביל לסימון תוך-תאי לא רצוי של חלבונים בשלב הבא, שהוא ליזיס של התאים.

החלבונים שעל פני השטח של התא מסומנים כעת, והתאים נשטפים ומוכנים לליזיס. המשקע משלב השטיפה האחרון מומס מחדש ב-150 µL של בופר ליזיס קר המכיל 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM magnesium acetate ב-pH 8.5, ומושאר על קרח למשך שעה אחת לפחות עם ערבוב קל מדי פעם במערבל Vortex. הדגימות מוכנות כעת להפרדה דו-ממדית (2D).

השלב הראשון באלקטרוליזה הוא הכנת פסי IPD להידרטציה מחדש. הכינו תמיסת הידרטציה מחדש על ידי הוספת בופר IPG המתאים למנעד ה-pH של הפסים שבהם נעשה שימוש, והוסיפו את התמיסו לתבנית ההידרטציה מחדש. הסירו את קולט ההגנה של פס ה-IPG והניחו את הפסים בזהירות, כאשר הג'ל היבש פונה כלפי מטה, אל תבנית ההידרטציה מחדש המכילה את תמיסת ההידרטציה מחדש.

סגרו את מכסה קופסת ה-IPG והשאיבו את הפסים למשך לילה. בממד הראשון, מיקוד איזואלקטרי, החלבונים מופרדים לפי ה-pi שלהם. פעולה זו מבוצעת באמצעות ה-IPG four three.

הרצועות שהוחזרו למצב הידרטציה מוcephalות למניפולטור (manifold) והאלקטרודה מורכבת מעליהן. 50 micrograms מכל דגימה הועברו באמצעות מכסי יישום דגימות. יישמנו ישירות דגימות שאינן מופרדות ללא הפרדה מוקדמת, או הפרדנו את הדגימות לfrakציות ממברנה וציטוזול לפני שהועברו.

העופרת סגורה כדי להגן על הדגימות הפלורסצנטיות מפני אור. המכשיר תוכנת בהתאם להמלצות והופעל במהלך הלילה. ג'לים גדולים של 12% lamby הוצמדו באמצעות gel 12 למבוגרים.

תמיסת Coster displacing הוספה כדי למנוע היווצרות גלי פולימריזציית אקרילמיד בתוך הצינוריות. הג'לים הושארו לפולימריזציה למשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר המיקוד האיזו-חשמלי, הפסים מוסרים ומעבירים לשיווי משקל בבופר המכיל SDS בשני שלבים: ראשית שימוש ב-DTT להפחתת קשרי הדיסולפיד של שאריות ציסטין, ולאחר מכן אלקילציה באמצעות iodoacetamide כדי למנוע מודיפיקציה על ידי אקרילמיד.

טבילות ה-IPG נטבלות בבופר ריצה ומונחות בזהירות על גבי שני ג'לי ה-dig הגדולים. כדי למנוע כליאת אוויר בין הפסים לג'ל, יש להוסיף מעל פתרון 2% agro מומס עם bromo anol blue. הג'לים מוכנים כעת להפרדה במימד השני ב-SDS page. ב-SDS page במימד השני.

החלבונים יופרדו לפי משקל מולקולרי, ופעולה זו תבוצע באמצעות מערכת Tonal Six. מלאו את תא האלקטרופורזה בבופר הרצה אנודי, הכניסו את הג'לים ומלאו את התא העליון בבופר הרצה קתודי. תכנתו את ספק הכוח בהתאם להמלצות והריצו את הממד השני תחת הגנה מאור למשך ארבע עד חמש שעות בקירוב, או עד שחזית הצבע תגיע לתחתית הג'ל.

לאחר electrophoresis במימד השני, מניחים את קסטיות הג'ל באמצעות התפסנים במכשיר הדימיג'ר הפלואורסצנטי typhoon. ניתן לסרוק שני ג'לים ושלושה ערוצים בו-זמנית. התוצאה מ-two DL זו מראה רזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה בדגימה, אף שקיימות הגבלות ידועות לגילוי של חלבונים הידרופוביים ב-A two DL. התוצאות מראות נקודות רבות של סימון חדש על פני השטח של התא, המוצגות כאן בצבע אדום, אשר לא זוהו באמצעות פרוטוקול הסימון הסטנדרטי המוצג כאן בצבע ירוק.

תוצאות אלו מראות כי פרוטוקול הסימון של פני השטח של התא ספציפי מאוד לסימון חלבונים על פני השטח של התא. מכיוון שרק חלבוני פני השטח מסומנים, ניתן להדמיותיהם באופן קל יותר, וכך נמנעת עמעום על ידי חלבונים ציטוזוליים שכיחים. התמונה הפלואורסצנטית של ג'לים עם פרקציה של ממברנה לא מופרדת או פרקציה ציטוזולית מוצגת למעלה.

להלן תמונה של אותו ג'ל לאחר צביעה בכסף. התוצאות אינן מראות סימון פלואורסצנטי של חלבוני ציטוזול, אך הצביעה בכסף מראה כי קיימים חלבונים בג'לים. התוצאות מראות גם דפוסי מפת נקודות דומים במדגמים לא מופרדים ובשברים של ממברנה, דבר המעיד כי אין צורך בפרקציונציה לפני אלקטרופורזה דו-ממדית, מה שהופך פרוטוקול זה לפשוט ונוח.

SI two, SI three ו-SCI five מראים דפוסי סימון דומים וכולם תואמים לפרוטוקול שטח הפנים של התאים. ניסוי תזונתי בוצע באמצעות כל שלושת ה-side eye DI floor minimal dy למחקר של ביטוי דיפרנציאלי של חלבוני שטח פנים בתאי CHO תחת הרעבה מסרום למשכי זמן שונים. דגימות שטח פנים של CY two מכל הדגימות בניסוי אוגדו והושתמו כסטנדרט פנימי.

ניתן היה לעקוב אחר שינויים דיפרנציאליים של מספר חלבוני פני שטח של תאים במהלך תקופת ההרעבה. באמצעות פרוטוקול פני השטח של התא, זוהו למעלה מ-18 חלבוני ממברנה חדשים שלא זוהו בפרוטוקול הסטנדרטי לזיהוי החלבונים בג'ל ההכנה. היה צורך להוסיף תגמר (spike) לדגימת פני השטח כדי להקל על ההתאמה חזרה לנקודות בסט הנתונים האנליטי.

להלן התוצאות. התוצאות מראות רזולוציה גבוהה של מספר רב של חלבונים מפני השטח של התא. פרוטוקול זה ספציפי מאוד לחלבונים מפני השטח של התא, ולא נצפתה סימון של חלבונים תוך-תאיים.

באמצעות שיטה זו, ניתן לזהות כמות גדולה יותר של חלבוני שטח התא בהשוואה לפרוטוקול סטנדרטי, וכפי שכבר ראינו, זהו פרוטוקול פשוט מאוד לביצוע. אתם פשוט מסמנים את חלבוני שטח התא בעודם שלמים ומריצים אותם ישירות על הפרדה חשמלית דו-ממדית (2D electrophoresis) ללא הפרדת ממברנות. לכן, זהו פרוטוקול מצוין לחקר חלבוני שטח התא וההבדלים ביניהם באמצעות טכנולוגיית ה-D.