לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים
22 באוקטובר 2008
זהו מדריך כדי לשנות את הצורה של micropipettes זכוכית. באופן ספציפי, באמצעות חום ולחץ אוויר להתחדד הוא התרחב מבלי להגדיל את פתיחת קצה, המוביל פיפטה התנגדות נמוכה יותר. זה קריטי כדי להשיג הקלטות רעש נמוך של תאים קטנים אך שימושית ביישומים רבים.
הליך זה מתחיל במיקום קצה הפ pipette ליד סיב הליטוש בהגדלה של 100 פעמים. לאחר מכן, הפעל את לחץ האוויר והחימום. הסיב.
קצה הפ pipette יתרחב וייצור קצה בעל צורה קהה. כבה את החימום כדי לקבל פתח קטן יותר של הקצה. כבה שוב את הלחץ ואת החימום.
שלום, אני ברנדון ג'ונסון מהמעבדה של ד"ר מרים גודמן במחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת סטנפורד. היום נדגים לכם הליך להחלקת פיפטות patch באמצעות לחץ. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור תעלות יונים וטלאי ממברנה (membrane patches) בנוירונים של *C. elegans*.
אם כן, נתחיל. הכינו סט של שש עד 10 פיפטות למתיחה (patch pipettes). לעזרה, פנו למומחה מקומי או צפו בניסוי הוויזואלי שלנו להכנת פיפטות למתיחה ואלקטרודות חדות באמצעות מכשיר מתיחה תכנותי (programmable puller).
כדי להתחיל את הפרוצדורה, הגדירו לחץ בקו האוויר הדחוס לכ-40 PS.I, ולאחר מכן חברו את קו האוויר הדחוס לשסתום בקרה ארבע-דרכי. חברו קטע של צינור פלסטיק לשסתום ארבע-הדרכים וחברו מחזיק פיפטה ללחץ גבוה לקצה החופשי של צינור הפלסטיק. השתמשו במערכת מיקרו-פורג' (micro forge rig) כדי לבצע את ההברקה.
אנו משתמשים בערכת Ccpm two מבית LA Scientific. מערך זה כולל מחזיק פיפט ללחץ גבוה, פילמנט חימום מפלטינה הנשלט באמצעות דום רגל, ומיקרוסקופ המצויד בעדשות אוויר בעלות מרחק עבודה ארוך, עם הגדלה נמוכה של 10 times והגדלה גבוהה של 100 times. עדשות אלו הן אידיאליות מכיוון שקריטי להיות מסוגלים לצפות בפתח הפיפט במהלך הפרוטוקול.
בשלב הבא, וודאו ששסתום הלחץ נמצא במצב כבוי. לאחר מכן, הניחו פיפט במחזיק הפיפטים והדקו את החיבור עד לסגירה ידנית (finger tight) למען בטיחות המעבדה. וודאו שהפיפט מוחזק היטב במחזיק הפיפטים.
אחרת, לחץ האוויר יגרום להוצאת הפיפטה מהתושבת. כשלב אופציונלי, ניתן לצפות את הפיפטה במבודד הידרופובי כגון שעווה כדי להפחית את הקיבוליות ולשפר את מאפייני הרעש. כעת הניחו את תושבת הפיפטה במיקום המיקרו-פורג' (micro forge), ומקמו את תושבת הפיפטה על משטח המיקרוסקופ כך שגם הקצה וגם חוט הליטוש יהיו גלויים בהגדלה נמוכה של 10 פעמים במיקרו-פורג'.
קרב את הקצה למרחק של כ-50 מיקרונים מהסיב, ולאחר מכן עבור לעדשה אובייקטיבית בעוצמה גבוהה של 100; הן קצה הפ pipette והן סיב הליטוש צריכים להיות במיקוד ובתוך שדה הראייה. אם לא,כוונן את גובה הסיב. כיוון שלא ניתן לכוונן את מיקום ה-pipette, קצה ה-pipette והסיב צריכים להימצא בצדדים מנוגדים של שדה הראייה.
הימנעו ממיקום קצה הפ pipette קרוב מדי לסיב (filament) מכיוון שהוא יתרחב בעת החימום ועלול להיתקל ב-pipette שלכם. ברגע שקצה ה-pipette והסיב ממוקמים כראוי, סובבו את השסתום כדי להזרים אוויר תחת לחץ לתוך ה-pipette וחממו את קצה ה-pipette עד שההיצרות שמאחורי הקצה מתחילה להתנפח כלפי חוץ. הפסיקו את החימום לפני שקצה ה-pipette יתנפח יתר על המידה.
נדרשת התנסות כדי לקבוע את המרחק, החום והזמן המתאימים לצורה הרצויה. כשלב אופציונלי, ניתן גם ללטש את הקצה בהיעדר לחץ כדי להקטין את קוטר פתח הקצה. כמו כן, יש לזכור שניתן לחזור על שלבי ליטוש אלה כדי להגיע לדיוק מרבי.
כוון הן את הצורה והן את הממדים של קצה הפיפטה. עם סיום הליטוש, כבה את הלחץ והפנה את קצה הפיפטה לכיוון בטוח.
הסר את הפ pipette והנח אותה בקופסת אחסון נקייה שבה תהיה מוגנת מאבק. למען בטיחות המעבדה, וודא כי הלחץ כבוי לפני הסרת הפ pipette. אחרת, היא עלולה להידחף החוצה מתושבת הפ pipette.
עם הסילוק, הראינו לכם כיצד לבצע ליטוש בלחץ (pressure polish) לפיפטות לשיפור הקלטות patch clamp. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לצפות את סליל הליטוש בזכוכית בעלת טמפרטורת התכה גבוהה, כדי למזער את שקיעת המתכת המאודה על הפיפטות, ולהיזהר בעוד הפיפטות חשופות לאוויר בלחץ.
וודאו שהפיפטה מוחזקת בחוזקה במחזיק וכבו את אספקת האוויר לפני הוצאת הפיפטה מהמחזיק. זה הכל. תודה שצפיתם.
בהצלחה בליטוש בלחץ ובניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מדריך זה מפרט את שינוי צורתן של מיקרופיפטות זכוכית באמצעות חום ולחץ אוויר. תהליך זה מאפשר להרחיב את הקיצוף (taper) מבלי להגדיל את פתח הקצה, דבר החיוני להשגת הקלטות עם רעש נמוך ביישומים של תאים קטנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ייצור מיקרופיפטות
רקע
- מיקרופיפטות זכוכית הן כלים חיוניים בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
- התנגדות נמוכה יותר של הפיפטה נחוצה להשגות הקלטות באיכות גבוהה.
- שינוי הצורה יכול לשפר את הביצועים ביישומים שונים.
- טכניקה זו מועילה במיוחד להקלטות של תאים קטנים.
מטרת המחקר
- לספק שיטה לעיצוב מיקרופיפטות מזכוכית.
- להפחית את התנגדות הפיפטה ללא הגדלת פתח הקצה.
- לשפר את איכות ההקלטות מתאים קטנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקום חוד הפ pipette בקרבת סיב ליטוש בהגדלה גבוהה.
- הפעלת לחץ אוויר וחום להרחבת חוד ה-pipette.
- כיבוי החום להשגת פתח חוד קטן יותר.
- התאמות סופיות על ידי כיבוי הלחץ והחום.
תוצאות עיקריות
- ניתן לעצב מחדש את קצה הפיפטה לצורה קהה ביעילות.
- מתקבלת התנגדות נמוכה יותר ללא הגדלת גודל הקצה.
- שיטה זו משפרת את איכות ההקלטה מתאים קטנים.
- מדגימה גישה מעשית לשינוי מיקרו-פיפטות.
מסקנות
- עיצוב מיקרופיפטות מזכוכית הוא טכניקה בעלת ערך במחקרים בתחום מדעי העצבים.
- תכנון משופר של הפיפטה מוביל לאיכות נתונים טובה יותר.
- ניתן להחיל שיטה זו במגוון מחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ליטוש פיפטות באמצעות לחץ מפחית את ההתנגדות החשמלית בהקלטות patch-clamp מבלי לשנות את קוטר הקצה, ובכך מאפשר מדידות בעלות נאמנות גבוהה יותר של תעלות יונים מאוכלוסיות נוירונליות קטנות. שיפור טכני זה תומך בתיקוף מטרות בתהליכי גילוי תרופות למדעי המוח על ידי שיפור יחסי האות-רעש במבדקים אלקטרופיזיולוגיים. איכות הקלטה משופרת מגבירה את רמת הביטחון החזיונית במחקרים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של עירור נוירונלי ותפקוד סינפטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תפקוד תעלות יונים בנוירונים בעלי קוטר קטן, אשר הם קריטיים עבור יעדים לטיפול בכאב נוירופתי ובאפילפסיה.
- ערך תפעולי: מפחית שונות בהקלטות של תעלה בודדת על ידי מזעור רעשים המושרים מהפיפטה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר גאומטריות סטנדרטיות של פיפטות עבור פאנלים ניתנים לשחזור של סריקה אלקטרופיזיולוגית.
- ערך תפעולי: תואם למיקרו-פיפטות מזכוכית רכה וקשה, מה שמאפשר תכנון גמיש של בדיקות עבור סוגי מטרות שונות.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: תומך ביישומים של patch-clamp עם נקבים על ידי יצירת קצוות קהים המגבירים את היווצרות בועות ממברנה (membrane blebs) עבור חומרים מחוררים אנטיביוטיים.
- ערך תפעולי: מאריך את משך ההקלטה בתרביות נוירונליות ראשוניות, ובכך משפר את התפוקה עבור מחקרי אופטימיזציה של תרכובות מובילות.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת בזרימות עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהן פנוטיפוּג אלקטרופיזיולוגי מסייע בבחירת המטרה ובאפיון של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת תיקוף תפקודי של מטרות ערוצי יונים במודלים נוירונליים הרלוונטיים למחלה.
- סריקה: מספקת פיפטות בעלות התנגדות נמוכה לסריקת תרכובות בדיוק גבוה בפלטפורמות patch-clamp.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של זרם ומוליכות עם יציבות אות משופרת.
- מחקר תרגומי: מקלה על ביצוע הקלטות ארוכות (longitudinal) בנתחים אקוטים ובנוירונים בתרבית עבור מידול פרמקוקינטיקה-פרמקודינמיקה.
- שימוש חוזר ארגוני: דורשת שדרוג microforge בלבד, מה שהופך אותה לשיפור בר-הרחבה ובעלות נמוכה לתשתיות אלקטרופיזיולוגיה קיימות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את מידת הוודאות של תיקוף המטרה באמצעות פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים נקיים יותר.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור של הבדיקה בין אתרים ומבצעים על ידי סטנדרטיזציה של גאומטריית הפיפטה.
- ערך אסטרטגי: מפחית תוצאות שגויות שליליות בסריקת תעלות יונים על ידי מזעור רעשים טכניים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות go/no-go בתוכניות פרה-קליניות המטרות עוררות עצבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במיקרופיפטים ובאלקטרופיזיולוגיה.
- נחוץ מיקרופורג' (microforge) עם שסתום לחץ גבוה, פילמנט חימום ואופטיקה להגדלה.
- דורש סטנדרטיזציה של פרמטרי הלחץ, החום והתזמון בין משתמשים שונים.
- חובה להתחשב בהבדלים בין סוגי הזכוכית (סודה-lime לעומת בורוסיליקט) בתגובת הליטוש.
- מוגבל בשל הצורך במיקום ידני של הקצה ובמיומנות המפעיל כדי למנוע התרחבות יתר.
