ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

פיפטות קפילריות מזכוכית הפכו לנפוצות במעבדות עבור מגוון רחב של טכניקות, כגון אלקטרופורציה של תא בודד, מיקרו-הזרקת DNA ואלקטרופיזיולוגיה של patch clamp. כדי להכין אלקטרודות patch clamp קפילריות מזכוכית להקלטות, מושכת זכוכית סיליקט באמצעות מושך זכוכית תכנותי (programmable puller). קצות האלקטרודות מצופים בשעווה, ולאחר מכן הקצוות עוברים ליטוש באש ונשמרים לשימוש עתידי. שלום, אני מירים גודמן מהמחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת סטנפורד.

בסרטון זה, אדגים כיצד להכין פיפטות patch clamp ואלקטרודות חדות לאלקטרופיזיולוגיה. מיקרו-אלקטרודות מזכוכית, הנקראות גם פיפטות, מהוות כלי עבודה מרכזי באלקטרופיזיולוגיה כבר עשורים. כיום, פיפטות אלו מיוצרות מקפילריות זכוכית באמצעות מכשיר משיכה ניתן לתכנות.

בואו נתחיל. כדי להכין פיפטות לטכניקת patch clamp, אנו משתמשים בנימי זכוכית מסוג Sutter borosilicate שהם נקיים וללא אבק, ואנו משתמשים במכשיר משיכת מיקרו-אלקטרודות מסוג Sutter P-97. ספר המתכונים לפיפטות של Sutter (Sutter's Pipette Cookbook) הוא מקור מידע מצוין לפיתוח תוכניות משיכה מתאימות.

ראשית, הרימו את כיסוי האבק של השובך. לאחר מכן, קחו צינור קפילרי אחד מזכוכית מהקופסה. הקפידו להחזיר את המכסה כדי למזער את הצטברות האבק.

בשלב הבא, החליקו ביד אחת את הנימיון אל תוך החריץ באחד מצדי הסיב, והדקו מעט את התפסן. בשלב זה, התפסן צריך להיות הדוק מספיק כדי למנוע מהצינור ליפול, אך רפוי מספיק כדי שניתן יהיה להחליקו אל תוך החריץ. כעת, שחררו את מעצור המתכת הקפיצי באותו צד.

לאחר מכן, אחזו עם האגודל והאצבע במחברים המתכתיים המחוברים לתחתית שני הנשאיות. שחררו את מעצור הקפיץ המתכתי השני. משכו את הנשאיות זו לכיוון זו עד למקסימום והחזיקו אותן במקומן ביד אחת.

בשלב הבא, החליקו את המבחנה דרך בית הפילמנט אל תוך החריץ של הנשא בצד השני. הימנעו מדחיקת הזכוכית אל תוך פילמנט החימום. הדקו את התפסנים בשני הצדדים.

עליהם להיות הדוקים מספיק כדי להחזיק את הנשאיות במקומן, אך לא הדוקים מדי עד כדי ריסוק הזכוכית. כעת, סגרו את כיסוי האבק ולחצו על הכפתור הירוק. פיפטות בעלות קוטב מסומן להקלטות patch clamp נוצרות באמצעות תוכנית משיכה בת חמישה שלבים, עם חום ומהירות יורדים בכל שלב, וקוטב קטן בשלב הסופי.

תוכנית זו משתמשת בחום ובכבידה. ההליך להכנת אלקטרודות חדות דומה מאוד, אך במקרה זה, אנו משתמשים בנימה דקה מזכוכית מבית Warner Instruments, בעלת קוטר חיצוני של 1 mm וקוטר פנימי של 0.78 mm. כמו כן, אנו מחלקים תוכנית משיכה המשתמשת במנוע בנוסף לחום ולכבידה, כאשר תוכניות המשיכה מסתיימות.

הרימו את כיסוי האבק, שחררו את שני התפסים והוציאו את הפ pipette המוכנה. לאחר מכן, הניחו את ה-pipettes בקופסת עבודה. ניתן להכין את הקופסה על ידי הדבקת רצועת ספוג למסך של קופסת טיפים לפ pipette, ולאחר מכן חיתוך של שישה עד שמונה חריצים בספוג.

הכניסו את הפפטות לחריצים. לאחר שהקופסה מלאה בפפטות שנמשכו, עברו לשלב הליטוש באש (fire polishing) כדי ללטש את הפפטות. הגדירו מערך מיקרו-forge עם פילמנט חימום מפלטינה הנשלט באמצעות דווש רגל לפני תחילת הליטוש באש.

ראשית, הקיפו את הפפיטה בשעוות שיניים כדי להפחית את הקיבוליות ולשפר את מאפייני הרעש. לשם כך, החזיקו במאגר קטן של שעווה מומסת בקרבת מקום. הפילו לחץ אוויר בחלק האחורי של הפפיטה כדי למנוע מהשעווה לחדור אל הקצה.

לאחר מכן, טבלו את הקצה למשך זמן קצר בשמע wax הנוזלי. הוציאו אותו כעת. הניחו את הפיפטה במכשיר הליטוש וקרבו את הקצה למרחק של כ-50 מיקרון מהסיב.

יש לזכור כי הפילמנט יתרחב בעת החימום. יש להפעיל פולס חום קצר של שנייה אחת או שתיים כדי להסיר את השעווה מקצה הפיפטה ולהחליק את הזכוכית. יש לבחון את קצות הפיפטות תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את קוטר הפתח ואת רמת החלקות.

עבור הקלטות patch clamp סטנדרטיות, פתחי הקצה צריכים להיות בקוטר של מיקרון אחד עד שלושה; יש להשליך קצוות גסים, לא אחידים או לא סדירים. הניחו את הפ pipette המוכנה בתיבת עבודה, וודאו שאתם סוגרים את המכסה כדי להגן על ה-pipettes מאבק; חזרו על הפעולה עד לקבלת 10 pipettes תקינות. הרגשתי כעת כיצד להכין patch clamp pipettes ו-sharp electrodes באמצעות puller ניתן לתכנות.

ניתן להשתמש באותו הליך להכנת מגוון של כלי זכוכית, כולל מחטי הזרקה להשגת תוצאות אופטימליות ב-patch clamp. חשוב לזכור למשוך פיפטות חדשות נקיות מאבק באותו היום של הניסוי, ולהנחיתן (polish) בתוך שעה מהניסוי. כמו כן, יש לוודא באמצעות בדיקה ויזואלית שהפיפטות חלקות ומלוטשות.

הקפידו לצפות בסרטון שלנו השני, המדגים כיצד לבצע הקלטת patch clamp של תעלות יונים המובעות בביצי Xenopus oocytes. אוקיי, זהו זה. כעת אתם מומחים בשימוש בפיפטה, ובהצלחה בניסוייכם.