Analisi di espressione genica da comunità microbiche marine utilizzando Trascrittomica Ambientale

Questa procedura inizia con l'acquisizione di biomassa microbica marina da campioni d'acqua mediante pre-filtrazione attraverso filtri da cinque e tre micrometri, seguita dalla raccolta su un filtro da 0,22 micrometri. L'RNA totale viene quindi estratto dagli organismi trattenuti sul filtro da 0,22 micrometri. Il nostro RNA viene rimosso dall'RNA totale mediante degradazione enzimatica selettiva e l'mr.N arricchito per ibridazione sottrattiva viene amplificato linearmente mediante aggiunta di coda poliA e trascrizione in vitro.

L'RNA antisenso amplificato viene quindi convertito in DNA a doppio filamento utilizzando esameri casuali. Il DNA risultante può essere clonato e sequenziato oppure sottoposto direttamente a pirosequenziamento. Ciao, sono Rachel Persky del laboratorio della dottoressa Marianne Moran presso il Dipartimento di Scienze Marine dell'Università della Georgia.

Oggi vi mostreremo un procedimento per analizzare l'espressione genica da campioni ambientali, utilizzando la metatranscrittomica ambientale. Scott Gifford vi mostrerà come processare campioni ambientali per il recupero dell'RNA.

Vi mostrerò come estrarre l'RNA dai campioni e dai RIN di Johanna. AON dimostrerà l'eliminazione dell'RNA. Successivamente, Maria Kosta illustrerà i passaggi di amplificazione dell'RNA e di sintesi del CD NA.

Iniziamo. Per iniziare il campionamento dell'RNA ambientale, si imposta il sistema di filtrazione posizionando un'estremità del tubo nell'acqua alla profondità desiderata per il prelievo e collegando l'estremità opposta a un filtro ad alto volume da tre micrometri, inserendo la pompa tra le due estremità del tubo. Il filtro da tre micrometri viene quindi collegato alla colonna filtrante da 0,22 micrometri e il flusso in uscita dalla colonna da 0,22 micrometri viene indirizzato in un contenitore graduato.

Fare passare diversi litri di acqua attraverso il sistema per il risciacquo. Al termine, rimuovere il tubo dall'acqua mentre la pompa è in funzione, per eliminare l'acqua residua dalla linea. Successivamente, utilizzare una pinza per posizionare un filtro da 0,22 micrometri sulla torretta del filtro e chiuderla.

Riportare l'estremità del tubo in acqua e accendere la pompa. Lasciare che l'aria venga espulsa sia dai filtri che dal sistema, monitorando il volume di acqua filtrata sul carboy. Una volta raggiunto il volume desiderato, rimuovere il tubo dall'acqua e far uscire l'acqua rimanente dal sistema.

Non appena il filtro è asciutto, rimuovere rapidamente la piastra superiore del filtro e piegare la carta da filtro. Posizionare il filtro in un contenitore whirl pack e congelare rapidamente in azoto liquido. Prima di iniziare l'esperimento, è importante ricordare che poiché gli RNA sono ubiquitari e gli mRNA si degradano rapidamente, è necessario seguire le normali precauzioni per lavorare in un ambiente privo di ribonucleasi, inclusi le superfici di lavoro e le pipette.

A tal fine, è necessario indossare guanti puliti quando si manipolano i materiali utilizzati in questa procedura. Inoltre, i campioni devono essere processati nel minor tempo possibile. Per iniziare l'estrazione di RNA totale dal filtro da 0,22 micrometri, prepariamo i tubi per la lisi meccanica aggiungendo otto millilitri di tampone RLT con beta meto etanolo a un tubo conico da 50 millilitri.

Quindi vengono aggiunti uno o due millilitri di perle per RNA da un kit di estrazione per suolo con alimentazione mobile. Rimuovere rapidamente il filtro congelato dal congelatore mantenendolo all'interno del world pack. Frantumarlo con un martello.

Aggiungere il filtro frantumato al tubo conico da 50 millilitri preparato e sigillare il coperchio del tubo con parafilm o nastro da laboratorio; vortexare per 10 minuti. Successivamente, centrifugare il tubo da 50 millilitri a 5.000 giri/min per un minuto. A temperatura ambiente, rimuovere la maggior quantità possibile del lisato e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri prima di centrifugare nuovamente per cinque minuti.

A 5.000 ×g, il soprannatante viene quindi trasferito in un nuovo tubo da 50 millilitri e viene aggiunto un volume di etanolo al 100% al lisato. Utilizzando una siringa da 10 millilitri, aspirare il lisato attraverso un ago da 18 a 21 gauge ed espellerlo circa cinque volte. Nei successivi passaggi di estrazione, utilizzare il kit KaiGen R e easy mini seguendo le istruzioni del produttore, applicando il lisato sulla colonna fornita mediante manifold a vuoto o mediante ripetute centrifugazioni.

Quantificare l'RNA totale mediante spettrofotometria. Dopo aver determinato il rendimento totale di RNA, utilizziamo il kit Ambien turbo DNA free seguendo le istruzioni del produttore per rimuovere eventuali contaminazioni di DNA. Ora che le estrazioni di RNA sono completate, consegnerò l'RNA totale a Johanna, che eseguirà i passaggi di rimozione del primo e del secondo RNA ribosomiale.

Grazie Rachel. Per iniziare la rimozione dell'RRNA, mescolare delicatamente e centrifugare brevemente il buffer di reazione 10x per mRNA solo 10 volte prima dell'uso in un tubo sterile privo di RNA da 0,5 millilitri; unire i volumi appropriati di buffer di reazione 10x, inibitore dell'RNA, campione di RNA totale ed esonucleasi terminator. Secondo il protocollo di Epicenter, incubare la reazione a 30 gradi Celsius per 60 minuti in un termociclatore con coperchio riscaldato o in un bagno d'acqua.

Successivamente, terminare la reazione mediante precipitazione con fenolo ed etanolo. Aggiungere prima acqua priva di RNAse fino a un volume totale di 200 microlitri, quindi aggiungere un volume uguale di una soluzione uno a uno di fenolo-cloroformio all'mRNA in centrifuga. Raccogliere la fase acquosa e quindi precipitare con etanolo al cento per cento e asportare. Questo rappresenta un possibile punto di interruzione.

L'RNA può essere conservato a meno 80 gradi Celsius fino al momento in cui si è pronti a utilizzare il campione in applicazioni successive. Una volta completato il primo arricchimento di mRNA, utilizzeremo i kit Ambien microbe enrich e microbe express seguendo le istruzioni del produttore per rimuovere qualsiasi residuo di rRNA dal nostro campione. Per facilitare la rimozione dell'rRNA eucariotico, utilizzeremo il kit microbe enrich.

Tutti i volumi sono determinati leggendo le istruzioni del produttore. Per iniziare, pipettare 300 microlitri di buffer di legame in un tubo da 1,5 millilitro. Aggiungere da 5 a 100 microgrammi di RNA totale in un volume massimo di 30 microlitri e vortexare.

Aggiungere delicatamente due microlitri di mix di oligonucleotidi di cattura per cinque microgrammi di RNA nel buffer di legame e battere leggermente sul tubo. Centrifugare brevemente il campione. Denaturare la miscela a 70 gradi Celsius per 10 minuti, quindi incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora.

Durante questa incubazione, preparare le microsfere magnetiche oligo lavandole una volta in acqua priva di nucleasi e una volta in buffer di legame, raccogliendo le microsfere su un supporto magnetico tra un lavaggio e l'altro. Conservare le microsfere sul ghiaccio e portarle alla temperatura ambiente. Cinque minuti prima dell'uso, riscaldare la soluzione di lavaggio a 37 gradi Celsius in un blocco termico.

Aggiungere la miscela di oligonucleotidi di cattura dell'RNA ai magnetobeads con oligonucleotidi, mescolare delicatamente il tubo e centrifugare brevemente. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Posizionare il tubo nel portaprovette magnetico e attendere circa tre minuti prima di aspirare il soprannatante contenente l'mRNA e trasferirlo in un tubo di raccolta posto sul ghiaccio.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione di lavaggio preriscaldata alle perle catturate. Vortexare delicatamente per catturare le perle e recuperare il soprannatante. Trasferire questo soprannatante, contenente l'RNA, nel tubo di raccolta posto sul ghiaccio.

Posizionare una provetta di raccolta sul ghiaccio durante la preparazione per rimuovere l'RRNA procariotico utilizzando il kit Ambi Microbe Express, che useremo per eliminare l'RRNA procariotico residuo. Utilizzare il Bioanalyzer o l'Experion per verificare la contaminazione da RRNA e la qualità dell'MR.NA. Questo rappresenta un possibile punto di interruzione.

L'RNA può essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Una volta rimosso l'RRNA, utilizzeremo il kit Ambien Message AMP due batteri secondo le istruzioni del produttore per amplificare il nostro mRNA. Ora che abbiamo un campione puro di mRNA, passerò l'esperimento a Maria, che vi guiderà attraverso l'amplificazione dell'mRNA e la sintesi del CDNA.

Grazie, Hannah. Prima di iniziare l'amplificazione dell'mRNA, calcolare i volumi di ciascun componente delle miscele master del kit Ambien message AMP due batteri online; iniziamo la poliadenilazione dell'RNA modello posizionando fino a 1000 nanogrammi di RNA totale in una provetta microfuga sterile priva di RNA. Utilizzare 6,5 microlitri di campione e nessuna acqua libera da RNA nel primo tampone per sintetizzare un RNA mediante trascrizione in vitro.

Si raccomanda l'utilizzo di un forno per ibridazione o di un incubatore grazie alla loro temperatura uniforme. E poiché è estremamente importante che non si formi condensa all'interno delle provette, raccomandiamo vivamente un'incubazione della reazione di trascrizione in vitro di 14 ore. Per massimizzare il rendimento di RNA-A ed ottenere il rendimento più alto di RNA-A, eseguire la IBT in un volume di reazione finale di 40 microlitri e conservare l'RNA-A a -80 gradi Celsius in aliquote di circa 10 microlitri.

Una volta che l'RNA è stato amplificato, è il momento di sintetizzare il DNA complementare o cDNA. Il kit Promega Universal RiboClone™ di sintesi del cDNA viene utilizzato per sintetizzare il cDNA a partire dall'RNA. Il kit fornisce istruzioni per convertire due microgrammi di RNA in cDNA. Si raccomanda un'input di sei-dieci microgrammi di RNA e di scalare le reazioni di conseguenza.

Pulire il DNA cCDNA utilizzando una precipitazione con etanolo oppure il sistema Promega Wizard DNA Cleanup, seguendo le istruzioni del produttore. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius. A questo punto, il cDNA a doppio filamento può essere direttamente sequenziato. Da 10 litri di acqua di mare, abbiamo estratto circa 10 microgrammi di RNA ambientale e lo abbiamo amplificato di 20 volte mediante la conversione dell'RNA amplificato in cDNA a doppio filamento, ottenendo quantità sufficienti di materiale per il sequenziamento e l'analisi dei trascritti ambientali. Vi abbiamo appena mostrato come valutare l'espressione genica nelle comunità microbiche marine utilizzando la metatranscrittomica ambientale.

Ricordare sempre che durante questa procedura l'mRNA si degrada rapidamente e che gli RNA sono ubiquitari. Pertanto, adottare le normali precauzioni per lavorare in un ambiente privo di ribonucleasi ed elaborare i campioni il più rapidamente possibile. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.