Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ciao, mi chiamo Ena e nel laboratorio eseguiamo regolarmente analisi del profilo di espressione genica. Utilizziamo questa tecnica per monitorare i geni regolati in modo differenziale tra met e tipo selvaggio. Oggi ho dei campioni di RNA di tipo selvaggio e met e procederemo prima con la C.

Utilizziamo metodi di etichettatura indiretta e il vantaggio di questa tecnica consiste nel prevenire il bias visivo che può verificarsi nell'etichettatura diretta. Per fare ciò, abbiamo campioni di RNA e optiamo per ottenere tre microgrammi di RNA in un volume totale di 13 microlitri. Aggiungiamo inoltre 2,5 microlitri di esamero casuale nei nostri tubi.

E incubiamo il campione a 75 °C per ottenere la denaturazione dell'RNA per otto minuti. A questo punto aggiungiamo il cocktail di trascrizione inversa, che contiene mix di dNTP, buffer per la trascrittasi inversa e anche l'enzima Big ET TT. Mescoliamo bene e incubiamo il campione a 42 °C per quattro ore. Dopo quattro ore, preleviamo semplicemente i campioni.

E ora nel tubo abbiamo una miscela di cDNA e RNA. Quello che vogliamo fare è idrolizzare l'RNA aggiungendo idrossido di sodio ed EDTA; la concentrazione finale dell'idrossido di sodio deve essere di cento molarità, e la concentrazione finale dell'EDTA deve essere di cinque molarità.

E ora incuberemo i campioni a 65 gradi in bagno termocontrollo per 10 minuti. L'incubazione è terminata e utilizzeremo i campioni aggiungendo acqua pH 7 HEPESS 1 alla concentrazione finale di 500 molar. A questo punto è possibile conservare i campioni a -20 gradi oppure proseguire con la purificazione.

Per la purificazione del cDNA, utilizziamo il kit di purificazione PCR KaiGen. Tuttavia, poiché il buffer Bush e il buffer ionico contengono agenti gelificanti, prepariamo autonomamente il nostro buffer Bush fate e il buffer ionico fate, quindi aggiungeremo 300 litri di PPI e pipetteremo lentamente questa soluzione; trasferirete successivamente la miscela nelle colonne e centrifugherete per un minuto alla velocità massima. Successivamente, utilizzerete il buffer di lavaggio al fosfato che abbiamo preparato, aggiungendo 750 microlitri e, ancora una volta, ripeterete l'operazione.

Perciò centrifugheremo nuovamente, solo per assicurarci di aver recuperato tutto il pellet. Trasferiremo poi queste provette in provette pulite. Aggiungerò 30 marcatori di tampone fosfato E, che è costituito da quattro molarità di fosfato di potassio a pH 8,5.

E qui devi semplicemente assicurarti di aggiungere tutto al centro della colonna e di incubare a temperatura ambiente per un minuto. Quindi centrifugerà nuovamente per un minuto e aggiungerò un altro buffer di 30 micro zero, che incubo a temperatura ambiente. Poi rimuovo la colonna e otteniamo un volume totale di 60 micro di CDA.

Dopo aver purificato il CDNA, è possibile conservarlo a meno 20 gradi; in alternativa, possiamo essiccarlo e poi conservarlo, quindi possiamo essiccare il CDNA in feedback. Ora, nel tubo, abbiamo CDNA secco, che è modificato. Quello che faremo sarà sospendere il campione secco in.

Sospendo il campione in 10 µL di 15 mM bicarbonato a pH 9. Eseguo questa operazione semplicemente aspirando e dispensando più volte; a questo passaggio è molto importante risospendere completamente il cDNA. Perché la reazione di incorporazione funzioni, questa deve avvenire al buio poiché le etichette fluorescenti sono sensibili alla luce.

Tuttavia, la scelta di questi dalla vita delle scienze e il loro arrivo in pacchetti individuali. S cinque ha un tappo viola e il lato tre ha un tappo arancione e inoltre S cinque appare ciano quando viene sospeso e Cary appare magenta. Quindi quello che farò in una stanza buia è trasferire questi campioni in provette colorate, ri-sospendere il colorante e trasferirli nuovamente nel tubo che ho.

Quindi incuberò al buio per due ore; dopo due ore di incubazione, interromperò la reazione aggiungendo 35 µL di acetato di sodio 100 millimolare a pH 5,2. Successivamente, eseguiremo una purificazione con una procedura di pulizia simile. Tuttavia, questa volta utilizzeremo il tampone di lavaggio e il tampone di eluizione forniti da Cajun.

È possibile descrivere i punti in cui si è posizionato il campione e che dovrebbero servire a pulire lo strumento. Quindi potete posizionare il vostro campione o la vostra miscela proprio ora in I To. Questo è il mio campione etichettato con scifi e qui osserviamo l'OD a 260, che indica il contenuto di CDA, e l'OD a 650, che indica l'incorporazione di D per scifi. Ecco qui il mio campione etichettato con side tre.

Di nuovo, ruotare sei concentrazioni e cinque misure del sito di incorporazione 50. Poiché la mia società D funziona in modo efficiente, combinerò ora i campioni. Ora, la signorina Miss lo esaminerà brevemente. E adesso riscriveremo un campione utilizzando il feedback.

Ok, quindi per l'ibridazione del vetrino, eseguiremo la riidratazione posizionando il vetrino sopra l'acqua, il che renderà le macchie più grandi. Successivamente, per proteggerle, eseguiremo un'essiccazione rapida a cento gradi Celsius e poi procederemo all'ibridazione UV o al cross-linking UV delle macchie sul vetrino; infine, incuberemo nel tampone pre-ibridazione che abbiamo preparato. Posiziono quindi il vetrino con la faccia rivolta verso il basso, ma senza farlo ancora toccare l'acqua.

E aspetteremo così per cinque minuti. Io, dato che questa scatola sembra più grande, dovrebbero essere più brillanti rispetto a prima di averli inseriti, e si seccheranno rapidamente ponendo il vetrino a cento gradi, osservando poi la formazione di condensa. E procederemo con il cross-link insieme a te.

Per l'idratazione, immergerò semplicemente il vetrino nell'acqua pre-riscaldata. Questa operazione deve essere molto rapida, poiché l'obiettivo è eliminare tutti i residui o tutti gli oligonucleotidi non legati presenti sul punto. Se si procede troppo lentamente, si otterranno code a cometa sui punti.

Quindi assicurarsi di eseguire rapidamente l'operazione e di non rimuovere la lamella dall'acqua; eseguire questa procedura per 30 secondi, quindi fissare immediatamente a temperatura ambiente per cinque minuti a 700 air pm. Prendere questo campione, inserirlo nel buffer della stazione pre-riscaldata che abbiamo preparato e inserire lentamente la lamella nel barattolo; quindi incubare a 42 gradi per almeno 45 minuti. Ecco qui il nostro campione essiccato da ibridare. Per prima cosa, risospendere in acqua.

In questa fase, si risospende semplicemente agitando su e giù, evitando di esporre troppo il campione alla luce bianca. Successivamente, si aggiunge il DNA spermatico di qualcuno, 1,5 µg, con una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro. E si aggiungono 1,2 µL di TRNA.

La concentrazione è di 12,5 milligrammi per, aggiungiamo tRNA e DNA di sperma di salmone per bloccare l'ibridazione non specifica. E aggiungiamo 5,35 marcatori zero tre XSSC, che fornisce una concentrazione finale di tre x. E infine aggiungiamo 3,5 microlitri di SDS all'1%.

Ora faremo bollire la miscela per cinque minuti e poi centrifugheremo alla velocità massima per cinque minuti, dopodiché sarà pronta per essere utilizzata. È passata un'ora da quando abbiamo incubato il nostro vetrino e ora ho acqua e isopropanolo. Agiterò quindi il vetrino prima nell'acqua per rimuovere l'SDS, poi lo laverò con l'isopropanolo e lo metterò direttamente nel calibro standard.

E qui, fate attenzione a non esporre troppo la luce all'aria per evitare l'essiccazione. Quindi passo direttamente dal buffer della stazione harm all'acqua e laviamo il vetrino. Alcuni minuti, assicurandosi che il movimento sia solo verticale, non laterale.

E assicurarsi anche che il vetrino non sia sopra l'acqua e lo trasferiremo immediatamente nell'isopropanolo. E lasciarlo nuovamente qui per alcuni minuti. E potrebbe la sua pagina rispondere alla sua pagina a temperatura ambiente per cinque minuti?

700 R.Cool. Quindi il nostro vetrino è anche pronto per l'ibridazione ed è meglio se lo si conserva in una scatola per vetrini per proteggerlo dai movimenti del bus. Per la stazione di raccolta utilizzeremo il lift o lo slip.

Ci sono strisce bianche sul vetrino che forniranno un certo sollevamento e creeranno uno spazio per il nostro campione tra il vetrino e il portaoggetti. Lo pulisco con etanolo e poi posiziono il filo, assicurandomi che non ci siano particelle di prova. Per prima cosa prendiamo il nostro portaoggetti modello con l'area di stampa segnata e, sopra di esso, posizioniamo il portaoggetti che abbiamo preparato, verificando che siano perfettamente allineati.

Assicurarsi che siano perfettamente allineate. È necessario verificare che le strisce siano sul lato che verrà rivolto verso il basso. È molto difficile da vedere, ma accertarsi di poterle distinguere.

E le strisce devono trovarsi sui lati dei vetrini. Caricheremo il nostro campione dai lati. Prelevo piccole quantità di campione, quindi inizio con 15 microlitri e comincio a caricare dall'angolo del coprioggetto.

E lentamente lo tirerei verso di me, muovendomi lungo il bordo per coprire tutta l'area. A questo stadio è molto importante non introdurre bolle d'aria; prendo quindi un altro migratore da 15 µL e lo applico ai lati dei vetrini per prevenire qualsiasi essiccazione. Il nostro campione è ora pronto e si procederà all'incubazione dei vetrini e delle camere di ibridazione, che presentano microcanali per mantenere idratato il vetrino durante l'ibridazione.

Aggiungeremo 10 µL di 3x SSC in sei angoli del vetrino. C'erano sei posizioni sulla, sulla camera, scusate, su ogni angolo e su ogni lato. Assicurarsi di trasferire il vetrino molto delicatamente in modo che il coprioggetto non scivoli via. Quando si posiziona il vetrino con il lato giusto rivolto verso l'alto, si noterà che si sovrapporrà e aderirà all'acqua che si è aggiunta; quindi posizionare il coprioggetto e assicurarsi che le viti siano ben strette.

Incuberemo la camera di reazione a 65 gradi in un bagno d'acqua, ma non vogliamo posizionarla direttamente sul fondo. Quindi inseriamo una barriera di plastica per evitare un eccessivo trasferimento di calore. Poi posizioniamo delicatamente la nostra camera di amplificazione e, per prevenire qualsiasi spostamento, è possibile aggiungere un piccolo peso.

E quest'incubazione proseguirà per tutta la notte, tipicamente tra 10 e 12 ore. Per il lavaggio della sezione, utilizziamo un XSSC con SDS allo 0,05 per cento. Questo servirà a rimuovere il vetrino coprioggetto.

E questo servirà per il lavaggio del primo passaggio. Eseguiremo altri due passaggi utilizzando soltanto lo 0,06% di six XSC attraverso tutti gli SDS presenti. Quindi chiudiamo ermeticamente il contenitore e prendiamo i vetrini, posizionandoli a faccia in giù nel contenitore per l'immersione.

E agiteremo delicatamente da un lato all'altro e vedremo che il coprioggetto cadrà dolcemente. Bene, e poi lo trasferiremo in un altro buffer di lavaggio che contiene XES. Incubare per un minuto.

Spostarsi nell'oh sei XSSC. E per assicurarsi di essersi liberati di tutto il FDS, ripetere ancora una volta. Centrifugare fino a completa asciugatura a temperatura ambiente per cinque minuti a 700 RP. Conservare questo vetrino nella scatola dei vetrini perché è sensibile alla luce.

Questo è uno scanner per vetrini e si inserisce il vetrino qui, in questo piccolo spazio, posizionandolo a faccia in giù, con l'etichetta rivolta verso l'alto. Nel secondo vetrino, si definirà semplicemente l'area che si desidera scansionare. Si selezionerà proprio questa area nei nostri vetrini. Utilizziamo 16 perni per stampare i nostri vetrini.

Ogni blocco corrisponde quindi a un pin e i nostri vetrini contengono oltre 8.000 punti. Rappresentiamo il genoma di vi color due volte perché comprende circa 4.000 geni. Per questo abbiamo due punti per ogni oligonucleotide utilizzato.

E se si ingrandisse, in questo particolare esperimento si osserverebbe il confronto tra mutanti del regolatore della trascrizione e il tipo selvaggio, in cui il mutante è marcato con scifi, che conferisce un colore rosso. Il tipo selvaggio era site three, che conferisce un colore verde. Pertanto, qualsiasi elemento che appaia rosso, come questi punti, indica che l'abbondanza dei trascritti nel mutante era maggiore rispetto al tipo selvaggio.

Quindi appaiono rossi o in diverse tonalità di rosso, e qualsiasi elemento che appare verde indica un'abbondanza maggiore del trascritto nel tipo selvatico rispetto al mutante. Qualsiasi punto che appare giallo indica che quel trascritto era presente in uguale misura sia nel mutante che nel tipo selvatico. Quando vengono sovrapposti, appaiono gialli come questi punti.