Drosophila larvali NMJ Dissection
4 febbraio 2009
Questo protocollo dimostra come sezionare Drosophila in preparazione per immunoistochimica e / o immagini della giunzione neuromuscolare.
Questa procedura inizia posizionando una larva del terzo stadio sulla piastra di dissezione. Vengono inseriti dei perni alle estremità posteriore e anteriore della larva. Le forbici vengono utilizzate per aprire la larva e la pinzetta per rimuovere gli organi interni.
Infine, quattro ulteriori perni vengono posizionati in ciascun angolo della parete corporea della larva per mantenerla ben tesa durante la fissazione. Ciao, sono Jonathan Brent del Laboratorio di Brian McCabe del Dipartimento di Fisiologia e biofisica solistica presso la Columbia University College of Physicians and Surgeons. Oggi vi mostreremo la procedura per la dissezione della larva di drosophila e della MJ.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare lo sviluppo sinaptico della giunzione neuromuscolare. Cominciamo dunque. Nei larve di drosophila, ci sono 30 muscoli per emisegmento, il cui assetto all'interno della parete corporea periferica è noto.
In totale, 35 neuroni motori innervano questi muscoli secondo un modello altamente stereotipato. Per accedere alla giunzione neuromuscolare o NMJ, è necessario dissezionare con attenzione ogni larva mediante una dissezione appropriata. La NMJ può essere utilizzata per l'analisi mediante immunofluorescenza o elettrofisiologia.
Iniziare la procedura ponendo una goccia di tampone HL 3.1 su una piastra per dissezione. Il tampone viene preparato in anticipo e raffreddato sul ghiaccio. Prelevare con cura una larva di terzo stadio in fase di erranza dal lato della provetta utilizzando pinzette in acciaio inossidibile di grandi dimensioni.
Il movimento indica che la larva non è ancora entrata nella fase di pupazione. Posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto nella goccia di tampone sulla piastra di dissezione. Il tampone freddo anestetizzerà la larva e la manterrà ferma; utilizzare pinzette. Inserire un perno mnuchin tra le sfere posteriori, quindi posizionare un secondo perno vicino agli uncini boccali scuri in modo che la larva sia distesa e pronta per essere aperta.
Utilizzando forbici a molla, effettuare una piccola incisione orizzontale verso l'estremità posteriore delle larve. Inserire una lama delle forbici nella sci e praticare un taglio longitudinale verso l'estremità anteriore della larva. Successivamente, effettuare incisioni orizzontali all'estremità anteriore delle larve a sinistra e a destra del perno.
Per rimuovere organi come l'intestino, aggiungere alcune gocce di tampone HL 3.1 all'animale; l'intestino e altri organi galleggeranno nella soluzione e potranno essere staccati dal corpo utilizzando pinzette. Rimuovere anche il sistema tracheale insieme agli altri organi. Esporre ora i muscoli interni del corpo fissando all'indietro i lembi creati con le incisioni.
Assicurarsi di distendere le pareti del corpo in senso orizzontale e verticale quando si fissano i lembi. Rimuovere eventuali residui di organi e lavare una volta.
Aggiungendo del nuovo buffer HL 3.1, la larva è ora pronta per essere fissata con formaldeide appena preparata, diluita al 3,5% in una XPBS, immergendo completamente le larve e il fissativo e lasciando agire per 25 minuti. Al termine del periodo di fissazione, lavare le larve due volte con buffer HL 3.1 per tre minuti. Rimuovere con attenzione i perni e trasferire le larve in provette da 1,5 ml contenenti una XPBS, se necessario.
I larve possono essere conservate fino a due giorni a quattro gradi Celsius. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare le larve dissezionate immediatamente. Esistono diversi componenti fondamentali in una larva di drosophila correttamente dissezionata.
Prima di tutto, fare attenzione a non danneggiare i muscoli, in particolare il sei, il sette e il quattro. In secondo luogo, l'animale deve essere adeguatamente disteso. In caso contrario, la giunzione neuromuscolare potrebbe non essere accessibile o distinguibile.
Qui potete vedere una larva correttamente dissezionata. La giunzione neuromuscolare è chiaramente visibile e il sistema è ora pronto per gli esperimenti. Vi abbiamo appena mostrato come dissezionare una larva esofagea per studiare la giunzione neuromuscolare.
Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere i muscoli integri. Se i muscoli vengono danneggiati, non ci saranno giunzioni neuromuscolari da studiare. Questo è tutto.
Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo protocollo illustra come dissezionare larve di Drosophila in preparazione per l'immunohistochimica e/o l'analisi di imaging della giunzione neuromuscolare. La procedura prevede un'attenta posizione dei perni e l'uso di forbici e pinzette per preparare le larve ad ulteriori analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Immunoeistochemia
Sfondo
- I larve di Drosophila sono comunemente utilizzate negli studi neurobiologici.
- La giunzione neuromuscolare è un'area fondamentale per lo studio della trasmissione sinaptica.
- Tecniche di dissezione appropriate sono essenziali per un'analisi e un'acquisizione di immagini di successo.
- Questo protocollo fornisce un metodo standardizzato per la dissezione delle larve.
Scopo dello studio
- Preparare larve di Drosophila per l'analisi immunohistochemica.
- Facilitare l'imaging della giunzione neuromuscolare.
- Standardizzare le tecniche di dissezione per garantire la riproducibilità nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Posizionamento dei perni per stabilizzare le larve durante la dissezione.
- Utilizzo delle forbici per aprire le larve.
- Rimozione degli organi interni con pinze.
- Fissazione della parete corporea ai fini dell'acquisizione di immagini.
Risultati principali
- Una dissezione corretta permette una chiara visualizzazione della giunzione neuromuscolare.
- Metodi standardizzati migliorano la coerenza tra esperimenti diversi.
- Permette ulteriori studi sulla funzione e lo sviluppo sinaptico.
- Fornisce una base per future ricerche in neurobiologia di Drosophila.
Conclusioni
- La dissezione delle larve di Drosophila è un passaggio fondamentale per la ricerca neurobiologica.
- Le tecniche appropriate migliorano la qualità dell'analisi immunohistochimica.
- Questo protocollo rappresenta una risorsa preziosa per i ricercatori del settore.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La giunzione neuromuscolare (NMJ) della larva di Drosophila rappresenta un modello geneticamente accessibile per lo studio dello sviluppo sinaptico e della plasticità, offrendo un'elevata accessibilità e risoluzione a livello cellulare singolo. Questo protocollo di dissezione consente la preparazione riproducibile della NMJ per applicazioni successive come l'analisi di immagini, l'immunohistochimica e l'elettrofisiologia, sostenendo la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta. Fornendo un metodo standardizzato per isolare e visualizzare le strutture sinaptiche, la tecnica aumenta la fiducia predittiva nella valutazione degli obiettivi neurobiologici e nella chiarificazione dei percorsi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase di Scoperta e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione di ipotesi terapeutiche relative alla funzione sinaptica e ai percorsi neurosviluppatori.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione ad alta fedeltà dei pattern di innervazione tra motoneuroni e muscoli.
- Valore predittivo: Facilita la valutazione di interventi genetici o farmacologici sulla morfologia e funzione della giunzione neuromuscolare (NMJ).
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici standardizzati per lo screening di composti con accessibilità costante alle giunzioni neuromuscolari.
- Output quantitativi: Consente la misurazione del numero e delle dimensioni dei bouton sinaptici e della localizzazione delle proteine come parametri fenotipici.
- Scalabilità: Permette l'elaborazione parallela di larve per campagne di screening a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella meccanismi sinaptici conservati applicabili alla validazione di bersagli in disturbi neurodegenerativi e neuromuscolari.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte genetiche in Drosophila alla biologia sinaptica dei mammiferi attraverso vie conservate.
- De-risking meccanicistico: Permette una valutazione precoce dell'interazione con il bersaglio e della modulazione della via in un sistema vivo e integro.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro di dissezione si integra nelle fasi iniziali della scoperta permettendo la verifica di ipotesi, prosegue con l'identificazione di composti promettenti attraverso fenotipi sinaptici quantificabili e supporta la validazione preclinica mediante screening fenotipici rilevanti per la malattia.
- Biologia della Scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi sinaptici e la validazione funzionale dei bersagli mediante la visualizzazione diretta della giunzione neuromuscolare.
- Screening: Fornisce preparazioni pronte per saggi con letture strutturali e fluorescenti riproducibili per la valutazione di composti.
- Analisi: Genera dati quantitativi morfologici e immunoistochimici per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca Translazionale: Collega i meccanismi sinaptici di Drosophila a modelli preclinici attraverso percorsi molecolari conservati.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di bersagli neurologici in molteplici campagne di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sinaptici.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della preparazione della giunzione neuromuscolare tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale consentendo la rilevazione precoce di tossicità sinaptica o dell'interazione con l'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei neuro-obiettivi in base agli esiti sinaptici funzionali, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di Drosophila, microchirurgia e microscopia a fluorescenza.
- Richiede l'uso di piastre per dissezione, spilli per insetti, forbici a molla, pinzette e tampone HL 3.1.
- Necessita della standardizzazione della tensione applicata dagli spilli e delle condizioni del tampone tra diversi utilizzatori.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono stadi larvali e background genetici variabili che influenzano l'integrità muscolare.
- I limiti pratici comprendono l'elevata destrezza manuale richiesta e il potenziale danno muscolare in caso di dissezione imprecisa.
