CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Beh, ciò che è davvero unico del saggio Teer è che consente di visualizzare direttamente le cellule T specifiche per l'antigene. Il te, il teer è l'aspetto principale e unico del nostro saggio. Questo è abbinato a un passaggio di amplificazione che eseguiamo.

Sai, isoliamo le cellule T e poi le coltiviamo in un ambiente che arricchisce il campione con le cellule T di nostro interesse. Successivamente, siamo in grado di etichettare specificamente solo quelle cellule e di visualizzarle mediante citometria a flusso. Con saggi precedenti, come quelli con CSFE o i saggi di proliferazione disponibili da decenni, ciò che si ottiene è una misurazione complessiva e globale di ciò che accade nell'intera popolazione di cellule T.

Ma nel corpo sono presenti milioni di cellule T e queste riconoscono un'ampia varietà di pattern. Se si è fortunati, forse una cellula su due-trecentomila nel campione sarà quella che si sta cercando. Ecco perché questo saggio prevede passaggi di arricchimento.

E poi, grazie a un numero di test, e poiché si esegue una colorazione diretta, è effettivamente possibile visualizzare, al di fuori del rumore di fondo, una popolazione inferiore all'1% del numero totale di cellule. In questo modo si riescono a vedere differenze minime e si può ottenere un conteggio piuttosto preciso del numero di cellule T presenti in quel campione di sangue, ovvero di quelle presenti in quell'individuo, che riconoscono il vostro modello di interesse. Ma non finisce qui, perché i tetrameri permettono anche di etichettare non soltanto tali cellule T, ma di isolarle per ulteriori analisi.

E i tetrameri che utilizza sono effettivamente prodotti qui al BRI, è corretto? Sì. Siamo uno di un numero molto ristretto di laboratori nel paese che ha prodotto con successo tetrameri di classe due. Il nostro obiettivo è distribuire questi reagenti a costo ridotto a tutti i laboratori interessati ad adottare questa tecnologia.

Quali sono, secondo lei, gli aspetti più difficili o complessi di questo saggio in relazione alla sua riproducibilità in altri laboratori? Beh, a pensarci bene, ce ne sono due: la coltura delle cellule T. È qualcosa che in realtà è un po' un'arte.

Lei, ha quasi ogni giorno delle decisioni da prendere riguardo alla necessità di fornire ulteriori nutrienti o ulteriore spazio di crescita alle cellule. E poi la seconda parte, che ritengo probabilmente la più difficile per un operatore inesperto, è l'analisi dei dati. Capire quale parte del segnale rappresenti effettivamente una risposta positiva e quale parte sia invece semplicemente dovuta a fattori fisici o di attrazione.

E il fatto che ogni cosa abbia un certo grado di adesività è qualcosa che, ancora una volta, richiede molta esperienza, specialmente in contesti in cui la risposta complessiva sarà leggermente debole. In che modo le informazioni che otterrete con questo saggio potrebbero beneficiare i pazienti in questa fase? Uno dei primi indicatori che emerge in qualsiasi paziente affetto da malattia autoimmune è una sorta di costellazione di anticorpi specifici per quella malattia.

Sappiamo dai fondamenti fondamentali dell'immunologia che ogni volta che si verifica una risposta anticorpale, vi è sempre prima una risposta delle cellule T. Pertanto, se potessimo osservare in individui a rischio un aumento dell'attività delle cellule T che precede la formazione di anticorpi, ciò ci aiuterebbe a definire un nuovo livello di rischio o a identificare individui che stanno sviluppando autoanticorpi, aprendo così una finestra per terapie preventive. Questa procedura permetterà di purificare ed espandere cellule T CD4 positive specifiche per l'antigene e di visualizzarle mediante reagenti tetramerici e attrezzature come le cappe a flusso laminare di classe due.

Questo sarà lo spazio di lavoro principale per la procedura. Tubi conici da 50 millilitri, tubo principale per l'isolamento dei PBMC, un XPBS. Deve essere privo di calcio e magnesio, confezionato in foglio di alluminio avvolto per proteggere dalla luce, pipetta automatica, pipette CoStar da 10 mil, contenitori aerosol con inserti da 50 mil utilizzati per prevenire la contaminazione del centrifugo con sangue.

Pipette per centrifuga GS six R, pipette di Pasteur, tampone emolitico contenente 8,3 grammi per litro di cloruro di ammonio, 1,0 grammi per litro di bicarbonato di sodio, 0,04 grammi per litro di EDTA sodico trian blu, soluzione allo 0,2% in PBS, emocitometro, provetta conica da 15 millilitri, tampone di lavaggio contenente PBS integrato con due millimoli di EDTA più cinque grammi per litro.

Kit di isolamento BSA max CD quattro due acquistato da Milin biotech EP, blocco magnetico acquistato da stem cell technologies. Altre piattaforme di arricchimento cellulare magnetiche potrebbero essere utilizzate con uguale efficacia. Tubo in polipropilene da cinque millilitri, RPMI 1640 integrato con 25 millimoli di hippies utilizzato per preparare il mezzo per linfociti T, siero umano pooled utilizzato per integrare il mezzo per linfociti T, pen strip utilizzato per integrare il mezzo per linfociti T, filtro sterile da 500 millilitri con membrana da 0,22 micron, piastra sterile a 48 pozzetti utilizzata per la coltura di espansione in vitro, passaggio in incubatrice a 37 gradi in atmosfera di CO2, soluzione da 20 milligrammi per millilitro di peptide sintetico contenente l'epitopo di interesse.

Utilizzare un tubo in polistirene da 5 ml caricato con peptidi, appartenente alla classe due del sistema teer, per visualizzare le cellule T specifiche per l'antigene, insieme ad anticorpi anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25 utilizzati per ricoprire le cellule T specifiche per l'antigene. Impiegare un citofluorimetro Fax Calibur o equivalente prima di iniziare la procedura. Assemblare tutti i materiali e le attrezzature nel proprio posto di lavoro.

La seguente dimostrazione illustrerà i passaggi seguenti. Isolamento di PBMC, separazione di linfociti T CD4 positivi, coltura di espansione in vitro, visualizzazione dei linfociti T mediante teem o colorazione. Passaggio uno: isolamento di PBMC.

Prelevare un campione di sangue. Il sangue deve essere raccolto in siringhe o provette per sangue e anticoagulato con eparina in un rapporto di uno a cinquanta per prevenire la coagulazione; si prevede un rendimento di circa 1 milione di PBMC per millilitro di sangue. Circa il 40% di questi saranno cellule T positive per CD4.

Aliquotare il sangue in provette coniche da 50 millilitri, con 25 millilitri di sangue per provetta. Mescolare delicatamente il sangue prima che coaguli per distribuire uniformemente il plasma.

Aggiungere PBS portando il volume totale a 40 millilitri e sottoporre a stratificazione lasciando defluire 11 millilitri di fial inserendolo nel tubo ematico e rimuovendo con attenzione l'ausilio della pipetta dalla pipetta. Il fial si svuoterà lentamente nella parte inferiore del tubo. Una volta che il livello si sarà equilibrato, rimuovere lentamente la pipetta dal tubo ematico, chiudere con tappo i tubi ematici e trasferirli nell'aerosol dei contenitori.

Chiudere saldamente i contenitori e centrifugare a 900 volte G per 20 minuti senza frenata. È fondamentale non applicare alcuna frenata al termine della centrifugazione, poiché la forza di arresto potrebbe disturbare lo strato cellulare dopo la corsa. I PBMC dovrebbero formare uno strato bianco ben definito tra il plasma giallo soprastante e il fial trasparente sottostante.

Rimuovere delicatamente lo strato di cellule bianche del sangue utilizzando una pipetta di trasferimento e trasferirlo in un nuovo tubo. Alcuni plasma e fial possono essere aspirati insieme ai PBMC, ma evitare di aspirare qualsiasi parte dello strato di globuli rossi. Tipicamente, in questo passaggio, due tubi di sangue possono essere combinati in un unico tubo cellulare.

Per aumentare le dimensioni del pellet, aggiungere PBS fino a raggiungere un volume totale di 15 millilitri e centrifugare a 500 ×g per 15 minuti con freno basso; aspirare il liquido dai contenitori con un contagocce, avendo cura di non disturbare il pellet. Trattare con tampone emolitico aggiungendo da cinque a sei millilitri in ogni provetta e mescolando delicatamente per rimuovere i grumi. Incubare per non più di cinque minuti.

Aggiungere PBS portando il volume totale a 50 millilitri e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti. Per queste centrifugazioni più lente, i contenitori sotto pressione per aerosol non sono più necessari. Lavare due volte, aspirare il liquido utilizzando una pipetta di Pasteur, riempire il tubo con PBS e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti prima del passaggio finale di lavaggio; prelevare un’aliquota di cellule risospese, diluire con tripan blu e contare utilizzando un emocitometro.

Questo conteggio cellulare determinerà i volumi di reagente utilizzati nella separazione dei linfociti T. Passo due: separazione dei linfociti T positivi per CD4. Aspirare il liquido e aggiungere il buffer di lavaggio per portare il volume totale a 40 microlitri ogni 10 milioni di cellule. Di solito sono necessari 30 microlitri di buffer più il volume residuo del pellet.

Trasferire questo volume in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere il cocktail di anticorpi proveniente dai kit di isolamento CD4, 10 microlitri ogni 10 milioni di cellule per tubo, e porre sul ghiaccio per 10 minuti. Rimuovere il tubo dal ghiaccio, togliere il cappuccio e aggiungere 30 microlitri di buffer di lavaggio ogni 10 milioni di cellule.

Aggiungere le perle magnetiche del kit di isolamento CD4. 20 microlitri ogni 10 milioni di cellule per provetta e mettere sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere 10 volumi di buffer di lavaggio e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti.

Durante la centrifugazione, preparare il magnete e un tubo in polipropilene da cinque millilitri nel proprio posto di lavoro. Aspirare il liquido dal pellet cellulare. Aggiungere due millilitri di buffer di lavaggio e rimuovere i grumi utilizzando una pipetta di trasferimento.

Utilizzando la stessa pipetta di trasferimento, trasferire le cellule nel tubo da cinque millilitri e incubare nel magnete per 15 minuti. Decantare con attenzione la frazione di linfociti T CD4 positivi in un tubo da 15 ml marcato, capovolgendo il magnete e svuotando tutto tranne l'ultima goccia. Aggiungere altri due millilitri di buffer di lavaggio al tubo da cinque millilitri e rimuoverlo dal magnete.

Risciacquare delicatamente le cellule CD4 negative dalle pareti del tubo e trasferirle in un tubo da 15 ml marcato. Aggiungere due millilitri di mezzo per linfociti T in ogni tubo. Prelievarne aliquote per il conteggio cellulare e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti.

Diluire aliquote cellulari con trian blu e contare utilizzando un emocitometro. Questi conteggi cellulari determineranno il numero di pozzetti utilizzati per la coltura di espansione. Passo tre.

Aspirare il liquido della coltura di espansione in vitro dai pellet cellulari CD4 positivi e CD4 negativi in base al numero di cellule. Aggiungere mezzo ai globuli CD4 positivi per aggiustare il volume a 3 milioni di cellule per ml. Aggiungere mezzo ai globuli CD4 negativi per aggiustare il volume a 10 milioni di cellule per ml.

La coltura di espansione richiede 3 milioni di cellule CD4 negative per pozzetto e da due a tre milioni di cellule CD4 positive per pozzetto. In genere, le cellule CD4 positive rappresentano la popolazione limitante. Aliquotare le cellule CD4 negative nel numero appropriato di pozzetti di una piastra a 48 pozzetti.

Aggiungendo 300 microlitri in ciascun pozzetto, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi per un'ora. Rimuovere la piastra dall'incubatore, lavare i pozzetti aggiungendo 500 microlitri di mezzo fresco ed eseguendo 12-20 aspirazioni e dispense delicate utilizzando una pipetta transfer, quindi rimuovendo tutto il liquido. Questo lavaggio lascerà un strato di cellule presentatrici di antigene aderenti.

Al termine del lavaggio, aggiungere una quantità sufficiente di mezzo per inumidire il fondo di ciascuna pozzetta, circa 100 microlitri. In caso contrario, le cellule aderenti si seccheranno. Se necessario, aggiungere da due a tre milioni di cellule CD4 positive a ciascuna pozzetta.

Aggiungere ulteriore mezzo fino a raggiungere un volume totale di un millilitro in ogni pozzetto. Aggiungere il peptide desiderato a ciascun pozzetto. La concentrazione tipica per la stimolazione è di 10 microgrammi per millilitro.

Posizionare infine la piastra in un incubatore a 37 gradi per sette giorni. Dopo sette giorni, aggiungere 50 microlitri di hemo IL due in ogni pozzetto ogni giorno successivo.

Monitorare la crescita cellulare utilizzando un microscopio, alimentando le pozzette non ancora confluenti rimuovendo metà del mezzo, aggiungendo mezzo fresco e 50 microlitri di IL; dividere le pozzette confluenti sospendendo le cellule, spostando metà delle cellule in una pozzetta vuota, aggiungendo mezzo fresco e 50 microlitri di IL, quindi reinserire le cellule nell'incubatore. Le cellule in espansione saranno pronte per la colorazione teer dopo 13-15 giorni di coltura.

Passaggio quattro, visualizzazione dei linfociti T mediante colorazione con tetramero, acquistare o assemblare tetrameri corrispondenti al peptide. Combinazioni peptidiche-MHC utilizzate per stimolare i linfociti T positivi per CD4. Rimuovere la piastra dall'incubatore.

Aspirare con attenzione metà del mezzo da ciascun pozzetto. Trasferire un'aliquota di cellule da ogni pozzetto, tipicamente 75 microlitri o circa 50.000 cellule, in un tubo Fax in polistirene da cinque millilitri, aggiungere teer tipicamente un microlitro per ogni 50 microlitri di volume totale e incubare per un'ora a 37 gradi. È inoltre consigliabile colorare una seconda aliquota di ciascun pozzetto con un teer non abbinato come controllo negativo, etichettando le cellule con anticorpi anti CD tre, anti CD quattro e anti CD 25.

È possibile utilizzare marcatori anticorpali aggiuntivi o alternativi. Tuttavia, non utilizzare anticorpi marcati con PE poiché questo canale deve essere riservato ai teems per il momento. Inoltre, etichettare eventuali controlli monocromatici o di isotipo utilizzando cellule extra.

Incubare le cellule marcate con anticorpo da 15 a 30 minuti a quattro gradi. Lavare ogni provetta con da 0,5 a un millilitro di buffer di lavaggio e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti. Rimuovere con attenzione il liquido dalle provette, calibrare il citofluorimetro utilizzando perline di riferimento, provette di controllo monocromatiche, controlli isotipici ed et cetera.

Analizzare ogni provetta utilizzando il citometro a flusso. Le cellule tetra positive dovrebbero costituire una popolazione distinta all'interno delle cellule T CD4 positive espanse. Le cellule tetra positive sono solitamente CD25 positive e spesso CD4 high.