L'elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray
20 marzo 2009
Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly, P. taeda, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.
Questo video è stato prodotto da ricercatori della Warnell School of Forestry and Natural Resources dell'Università della Georgia. Lo scopo di questo video formativo è illustrare nel dettaglio come processare la nostra microarray di cDNA da pino lolly LOB, genotipo due, prestando particolare attenzione alle fasi di lavaggio e manipolazione della matrice, sia prima che dopo l'ibridazione. In generale, i nostri protocolli seguono quelli sviluppati presso l'Institute for Genomic Research Tiger e la Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, dove vengono stampate le nostre matrici.
Abbiamo constatato che è necessario un trattamento più rigoroso del PT Gen due per ottenere il massimo livello di coerenza rispetto all'uniformità della qualità del segnale e a fondi bassi. Il primo passaggio è un prelavaggio. Eseguiamo questo passaggio perché il nostro buffer di spotting contiene una concentrazione molto elevata di sale e questo prelavaggio è necessario per rimuovere tale sale.
I vetrini vengono posizionati in un portavetrini per microscopio e immersi vigorosamente da 15 a 20 volte in una soluzione di SDS 0,2% preriscaldata a 43 gradi. Dopo il lavaggio nella soluzione di SDS, vengono rimossi con cura mediante pinzette e trasferiti in un barattolo Copeland contenente un buffer di pre-ibridazione. Questo buffer contiene 5 XSSC, 0,1% SDS e 1% BSA ed è anch'esso riscaldato a 43 gradi.
Il barattolo di Copeland viene coperto con parafilm e posto in un incubatore a 43 gradi per un'ora. Dopo la pre-ibridazione, i vetrini vengono rimossi e trasferiti su un portavetrini per microscopio, quindi trattati successivamente con cinque cambi d'acqua deionizzata, immergendo da 15 a 20 volte in ciascun cambio. Infine, i vetrini vengono posti in isopropanolo ed immersi cinque o sei volte prima di essere centrifugati fino a completa asciugatura in una centrifuga chip M mate.
Dopo la centrifugazione, i vetrini vengono soffiati con aria compressa passata attraverso un filtro da 0,2 micron. Successivamente, i vetrini vengono ricoperti con coprioggetti sollevatori, che sono stati anch'essi puliti con aria compressa, e utilizziamo una piccola punta di pipetta per posizionare correttamente il coprioggetto sollevatore sul vetrino.
Dopo aver posizionato le lamelle portaoggetto, ma prima di aggiungere il buffer di ibridazione, aggiungiamo 20 microlitri di dihi 100 millimolari, tre atol nei pozzetti di umidità situati alle estremità della camera. Ora siamo pronti ad aggiungere i cDNA bersaglio, che sono stati risospesi nel buffer di ibridazione. La punta della pipetta viene posizionata sul bordo della lamella portaoggetto e del vetrino e la soluzione viene pipettata lentamente.
Abbiamo scoperto che l'utilizzo dell'effetto capillare per caricare le matrici garantisce la massima uniformità e riduce notevolmente l'introduzione di bolle indesiderate. Dopo aver aggiunto il materiale bersaglio alla matrice, la camera di ibridazione viene assemblata e coperta con carta d'alluminio. Successivamente, la camera di ibridazione viene posta in un bagnomaria agitato per un'incubazione notturna, tipicamente da 14 a 16 ore.
Il bagno d'acqua è impostato a 48 gradi e l'agitatore è impostato a 50 giri/min. È importante notare che, a partire dall'aggiunta della soluzione di ibridazione e per tutte le successive fasi di lavaggio post-ibridazione, le procedure vengono eseguite in condizioni di luce ridotta per prevenire l'ossidazione fotochimica. Il giorno seguente, i vetrini vengono rimossi dalla camera di ibridazione e posizionati in un barattolo Copeland contenente la soluzione di lavaggio numero uno, precedentemente riscaldata a 53 gradi.
Si lasciano i vetrini nel barattolo Copeland per circa un minuto, fino a quando i supporti cadono spontaneamente; a quel punto i vetrini vengono delicatamente rimossi con pinzette e posizionati in un portavetrini per microscopio per procedere con i lavaggi. Successivamente, i vetrini vengono immersi con vigore da 15 a 20 volte in un secondo contenitore, contenente anch'esso la soluzione di lavaggio numero uno a 53 gradi. Il contenitore viene quindi coperto con parafilm e collocato in uno shaker ad incubazione con agitazione aerea regolato a 53 gradi e 100 giri al minuto.
Dopo l'incubazione di 10 minuti e la soluzione di lavaggio numero uno, le vetture vengono immerse vigorosamente da 15 a 20 volte in un contenitore con la soluzione di lavaggio numero due, che si trova a temperatura ambiente. Questo contenitore viene coperto con pellicola parafilm e nuovamente posto su un agitatore a temperatura ambiente per un'incubazione di 10 minuti. Infine, le vetture vengono rimosse dalla soluzione di lavaggio numero due e immerse vigorosamente da 15 a 20 volte in un contenitore con la soluzione di lavaggio numero tre.
I vetrini vengono quindi trasferiti in un secondo contenitore con la soluzione di lavaggio numero tre coperta con perfil e nuovamente posti sullo shaker per 10 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, centrifughiamo i vetrini fino a completa essiccazione. Per fare ciò, inseriamo un tappo Falcon da 15 ml in un tubo conico da 50 ml e posizioniamo i vetrini con il lato del codice a barre rivolto verso il basso all'interno del tubo conico.
I tubi vengono quindi centrifugati in un rotore a cestello oscillante a 1500 giri al minuto a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, i vetrini vengono trasferiti in un secondo set di tubi conici da 50 ml, che sono stati ricoperti con carta d'alluminio. I tubi vengono quindi purgati con gas azoto, filtrato attraverso un filtro da 0,22 micron, e chiusi con tappo per il trasporto o per la conservazione fino alla scansione.
Raccogliamo i dati di scansione con un PerkinElmer ScanArray 5,000. L'immagine dell'array viene suddivisa in griglia e i dati grezzi della scansione vengono elaborati; l'analisi iniziale dei dati è effettuata mediante la suite software per imaging di BioDiscovery. Successivamente, i dati relativi all'intensità del segnale dei punti vengono normalizzati e le analisi statistiche sono eseguite con BRB ArrayTools, un pacchetto statistico per microarray robusto e disponibile gratuitamente, scaricabile dal National Cancer Institute.
Altri analisi statistiche e ricerche di modelli di espressione genica vengono effettuati con il pacchetto di analisi e modelli di espressione genica Jeep PPAs. Un altro pacchetto di analisi basato sul web disponibile gratuitamente. Grazie per aver guardato il nostro video su come processare il microarray PT Gen due della pino silvestre.
I seguenti individui hanno contribuito alla realizzazione e alla produzione di questo video formativo.
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Panoramica
In questo articolo viene presentata la microarray di cDNA PtGen2 sviluppata per studi sull'espressione genica nel pino marittimo e in altre specie di conifere. Vengono descritte le tecniche di manipolazione e lavaggio prima e dopo l'ibridazione, finalizzate a migliorare la coerenza e ridurre gli artefatti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Analisi dell'espressione genica
- Tecnologia dei microarray
- Biologia vegetale
Sfondo
- I microarray di cDNA sono essenziali per lo studio dell'espressione genica.
- PtGen2 è stato progettato specificamente per il pino marittimo e le conifere.
- Le tecniche appropriate di manipolazione sono fondamentali per ottenere risultati affidabili.
- L'elevato contenuto di sale nel buffer di spotting richiede un prelavaggio.
Scopo dello studio
- Per migliorare la coerenza dei dati sull'espressione genica.
- Per ridurre il rumore di fondo nei risultati delle microarray.
- Per fornire un protocollo standardizzato ai ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Pre-lavaggio per rimuovere il sale dal buffer di spotting.
- Tecniche di lavaggio stringenti dopo l'ibridazione.
- Confronto con protocolli di strutture di ricerca consolidate.
- Valutazione della qualità del segnale e dei livelli di fondo.
Risultati principali
- Osservata un’improvata coerenza nella qualità del segnale.
- Livelli di fondo più bassi ottenuti con tecniche affinate.
- I protocolli hanno dimostrato efficacia in più esperimenti.
- Sono state fornite raccomandazioni per studi futuri.
Conclusioni
- Tecniche migliorate di manipolazione e lavaggio sono fondamentali per il successo della microarray.
- Protocolli standardizzati possono portare a dati più affidabili sull'espressione genica.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi risultati per ottenere migliori risultati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo affronta una sfida fondamentale nella genomica vegetale: ottenere dati riproducibili da microarray nonostante i tamponi di spotting ad alta concentrazione salina, che possono introdurre artefatti. Standardizzando i passaggi di lavaggio pre- e post-ibridazione, il metodo migliora la coerenza dei dati e riduce il rumore di fondo, consentendo un profilo affidabile dell'espressione genica in specie di conifere. Ciò contribuisce agli sforzi di validazione degli obiettivi nella biotecnologia forestale, permettendo una rilevazione più chiara dei geni differenzialmente espressi in condizioni sperimentali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle risposte trascrizionali nei tessuti delle conifere, supportando la verifica di ipotesi relative a percorsi di stress o di sviluppo.
- Valore operativo: Riduce la variabilità tecnica derivante da artefatti salini, migliorando l'affidabilità nell'identificazione delle sequenze bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce vetrini per microarray standardizzati con fondo ridotto, adatti a ibridazioni riproducibili tra diversi gruppi sperimentali.
- Valore operativo: Stabilisce un flusso di lavoro robusto per la preparazione dei vetrini, che migliora la riproducibilità e la scalabilità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo profili di espressione affidabili da tessuti di pino, utili per lo studio dell'adattamento ambientale o della formazione del legno.
- Valore operativo: Favorisce la comparabilità tra studi attraverso un processo di preparazione delle diapositive costante, agevolando la continuità traslazionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel flusso di lavoro della biologia della scoperta, supportando in particolare un profilo affidabile del bersaglio in sistemi vegetali non modello in cui gli strumenti genetici sono limitati.
- Biologia della scoperta: Permette un'analisi dell'espressione guidata da ipotesi nel pino marittimo, chiarificando le risposte geniche nei tessuti di radice, ago e fusto.
- Screening: Fornisce vetrini per microarray con qualità del segnale uniforme, consentendo uno screening comparativo affidabile dell'espressione genica in condizioni diverse.
- Analisi: Genera dati di intensità del segnale puliti e normalizzati, compatibili con strumenti successivi come BRB Array Tools e JePPAs per l'analisi statistica.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità dalla scoperta del gene alla validazione funzionale fornendo basi affidabili per l'espressione genica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per la preparazione di vetrini applicabile a numerose specie di conifere e a diversi disegni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora l'affidabilità predittiva delle misurazioni dell'espressione genica riducendo al minimo gli artefatti derivanti da sali e SDS.
- Valore operativo: Potenzia la standardizzazione e la riproducibilità tra diversi vetrini e laboratori grazie a passaggi definiti di lavaggio e manipolazione.
- Valore strategico: Riduce il rischio di risultati falsi positivi o falsi negativi nel profilo di espressione, favorendo decisioni più accurate sui percorsi da intraprendere o abbandonare nella validazione del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei geni candidati adeguata al rischio, basata su dati di espressione più puliti e affidabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione di microarray e nelle tecniche di ibridazione.
- Necessita dell'accesso a bagni termici controllati, incubatori e centrifughe per l'elaborazione dei vetrini.
- Richiede reagenti standardizzati, tra cui SDS, SSC, BSA e isopropanolo, per i passaggi di lavaggio e disidratazione.
- Richiede l'adattamento del controllo dell'umidità e dei tempi di ibridazione in base alla fonte di RNA target e al metodo di marcatura.
- Limitazione pratica: il buffer di spotting ad alto contenuto salino richiede un prelavaggio rigoroso; una rimozione incompleta dei sali può persistere se i passaggi vengono abbreviati.
