Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Per mappare i siti di legame delle proteine ribonucleari sugli pre-mRNA, iniziare suddividendo la regione designata del pre-mRNA di interesse in finestre di 30 nucleotidi e sintetizzare gli oligo affiancati su un array. Gli oligo vengono eluiti dall'array mediante ebollizione e co-precipitati con un RNP di interesse. Il pool iniziale totale viene marcato con SCI tre e il pool legato viene marcato con SCI cinque; entrambi vengono quindi applicati all'array di rilevamento.

L'array viene quindi scansionato e si utilizza un software di estrazione delle caratteristiche per interpretare i risultati. Salts. Ciao, sono Kate Watkins del laboratorio di Will Fair brother del dipartimento di MCB della Brown University. Oggi vi mostrerò un procedimento rapido ed economico per determinare la posizione precisa di un complesso RNA-proteina su prem RA in laboratorio, rissintetizzando prem A come una miscela di oligonucleotidi sovrapposti.

Questo pool può quindi essere separato in una frazione legata e non legata mediante co-immunoprecipitazione e successivamente analizzato tramite microarray. Sebbene questa procedura abbia numerose applicazioni, noi la utilizziamo per studiare diversi fattori di splicing e il loro ruolo nello splicing alternativo. Cominciamo dunque.

Per iniziare questa procedura, utilizzare il browser genomica uc SC per scaricare geni specifici, giunzioni di splicing o altre regioni di interesse da cui progettare il pool prem A. Selezionare le finestre di interesse, quindi suddividerle computazionalmente con una lunghezza di lettura di 30 nucleotidi e un'overlap di 20 nucleotidi in modo che ogni oligo sia spostato di 10 nucleotidi rispetto al precedente. Una volta definiti gli oligo lunghi 30 nucleotidi, aggiungere a ciascuno sequenze universali di primer alle estremità.

Inviare gli oligo ad Agilent per la stampa su un microarray di oligonucleotidi personalizzato. Una volta ricevuto il microarray, iniziare il recupero degli oligo di DNA dalla sua superficie posizionando la lamella di copertura del microarray in una camera di ibridazione per array e pipettando delicatamente 500 microlitri di acqua deionizzata sulla lamella. Posizionare la lamella del microarray con la superficie sensibile rivolta verso il basso sopra la lamella di copertura, in modo che le etichette su ciascuna lamella siano rivolte l'una verso l'altra, avendo cura di evitare bolle d'aria che potrebbero interferire con il processo di recupero degli oligo.

Chiudere la camera di ibridazione e ruotarla tutta la notte a 99 gradi Celsius in un forno per ibridazione. Il giorno seguente, rimuovere con attenzione il chip dalla camera ed eliminare l'acqua, che ora contiene gli oligonucleotidi rilasciati dalla superficie del chip. Collocare il pool di oligonucleotidi rilasciati in una provetta Eppendorf da 1,5 millilitri e sottoporre a sonica per frammentare eventuali aggregati, utilizzando un'ampiezza del 50% per tre impulsi di tre-cinque secondi ciascuno. Successivamente, amplificare il pool mediante PCR a pochi cicli utilizzando primer universali con un promotore T aggiunto alla loro estremità.

Il numero di cicli richiesti può variare in base all'efficienza del recupero degli oligonucleotidi. Evitare un'eccessiva amplificazione, riconoscibile come una banda sfumata su un gel di acrilamide. Infine, utilizzare il kit Mega Short Script di Amon per la trascrizione dell'RNA.

Terminare la reazione di trascrizione mediante estrazione dell'RNA con cloroformio fenilico, seguita da precipitazione alcolica usando acetato di sodio e anche glicoblù come vettore. Risospendere il pellet di RNA in 105 microlitri di tampone TE. Per determinare con precisione la concentrazione dell'RNA.

Utilizzare il colorante RiboGreen per generare una curva standard. Successivamente, effettuare la misurazione mediante un lettore di piastre a fluorescenza. Il pool di RNA è ora pronto per l'immunoprecipitazione congiunta per avviare il saggio di pull-down.

Per prima cosa, preparare le microsferette magnetiche combinando microsferette Dyna di proteina A e proteina G in rapporto uno a uno, fino a un volume finale di 50 microlitri per reazione. Concentrare le microsferette in un unico punto utilizzando un supporto per separazione magnetica al fine di rimuovere il sopranatante. Quindi lavare due volte con un volume uguale di PBS 1X freddo dopo il secondo lavaggio.

Risospendere le perle in un volume uguale di PBS 1X freddo e aggiungere due nanogrammi di anticorpo per ogni reazione. Questa quantità può variare a seconda dell'anticorpo, quindi potrebbe essere necessario sperimentare per determinare le condizioni ottimali di legame dell'anticorpo alle perle. Incubare la miscela tutta la notte a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante.

Al mattino, aggiungere due microgrammi per reazione di RNA totale di lievito sonificato per bloccare il legame non specifico e ruotare per ulteriori 30 minuti a quattro gradi Celsius. Una volta completato il passaggio di blocco, utilizzare nuovamente il supporto magnetico per rimuovere il sopranatante. Quindi lavare le perle due volte con 1x PBS freddo, lasciando il PBS del secondo lavaggio nel tubo; aliquotare 50 microlitri della sospensione di perle in nuovi tubi.

Un tubo per ogni reazione di co-immunoprecipitazione. Le perle sono ora pronte per la co-ip. Successivamente, preparare il mix master combinando il pool di oligonucleotidi di RNA con l'estratto nucleare cellulare.

Come fonte di RNP, prelevare un'aliquote di 50 microlitri della miscela madre come protezione totale del campione. I primer, che sono versioni RNA dei primer universali, possono essere aggiunti per prevenire il legame delle proteine alla sequenza del primer o l'introduzione di una struttura secondaria all'RNA. Per avviare la co-immunoprecipitazione, rimuovere il soprannatante dalle aliquote di perle e risospendere le perle in 120 microlitri della miscela madre rimanente. Agitare le reazioni a quattro gradi Celsius per una o due ore.

Al termine dell'incubazione, una piccola quantità di Eloqua, inclusi i microsferini, può essere prelevata da ogni co-ip. Per ulteriori test sull'efficienza o specificità del legame, posizionare il resto delle reazioni sul magnete ed eliminare il sopranatante. Procedere quindi con uno o due lavaggi con XPDS freddo.

L'RNA legato all'anticorpo sulle perle tramite il RNP è il campione di IP. Ri-sospendere le perle di IP in 50 microlitri di SDS al 1% in tampone 0,1 XTE e riscaldare i campioni a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Per eluire l'RNA, rimuovere il surnatante, che ora contiene l'RNA precedentemente legato alle perle, e purificare mediante estrazione con fenolo-cloroformio, seguita da una precipitazione con etanolo; quindi ri-sospendere il pellet in 50 microlitri di tampone 0,1 XT.

Successivamente, effettuare la trascrizione inversa dei campioni utilizzando i primer universali inversi. Quindi, amplificare i campioni mediante PCR con i primer universali, uno dei quali deve contenere un promotore T7. Il numero di cicli necessari per amplificare il pool dipenderà dall'efficienza del co-ip.

Utilizzando il kit con script mega shorts di Ambion, trascrivere nuovamente i campioni, ma questa volta aggiungere due microlitri di amino allele UTP invece del T seven UTP fornito con il kit. L'amino allele UTP verrà utilizzato in seguito per etichettare l'RNA con gli side eyes. Al termine della trascrizione.

Eseguire l'estrazione con cloroformio fenilico e precipitare i campioni con etanolo. Non utilizzare glicoblù o acetato di ammonio, che potrebbero interferire con l'ibridazione dei campioni all'array. Risospendere il pellet in 4,5 microlitri di carbonato di sodio 0,1 molare.

Per etichettare prima i campioni, aggiungere 2,5 microlitri di acqua priva di nucleasi al campione totale. Aggiungere tre microlitri di S3 al campione di IP e tre microlitri di SCI cinque. Incubare al buio per un'ora.

A temperatura ambiente, interrompere la reazione aggiungendo sei microlitri di idrossilammina 4 M HCl a ciascun campione, mescolare accuratamente e centrifugare. Incubare brevemente per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi purificare i campioni marcati mediante estrazione con fenolo-cloroformio, seguita da precipitazione con etanolo. La maggior parte del colore viene trasferita nella fase organica insieme ai nucleotidi liberi, quindi i pellet potrebbero non apparire visibilmente colorati.

Risospendere ogni pellet in 50 microlitri di 0,1 XTE. Seguire le istruzioni del kit di ibridazione per microarray Agilent per preparare il campione per microarray, con la seguente eccezione: non frammentare l'RNA; dopo aver aggiunto il buffer di frammentazione, aggiungere immediatamente il buffer di ibridazione per arrestare la frammentazione.

Posizionare i campioni sull'array e ibridare a 50 gradi Celsius per tre ore mentre l'array è in rotazione. Preparare le seguenti soluzioni da 50 millilitri in provette coniche da 50 millilitri: una provetta di buffer SC in eccesso di due volte, due provette di buffer sea in eccesso di una volta e una provetta di acqua deionizzata.

Dopo l'incubazione di tre ore, rimuovere con attenzione le clip dal vetrino in sandwich e posizionarlo nella soluzione XSSC 2X. Utilizzando una coppia di pinzette, separare delicatamente il vetrino dal coprioggetto.

Rimuovere delicatamente il cover slide, avendo cura di non toccare l'array. Mentre si estrae il vetrino, chiudere il conico e capovolgerlo delicatamente per 60 secondi. Utilizzando le pinzette, trasferire l'array nella soluzione 1XSSC.

Chiudere il tubo e capovolgerlo delicatamente per un minuto. Successivamente, trasferire l'array nella seconda soluzione XSSC e capovolgere nuovamente delicatamente per un altro minuto. Infine, trasferire l'array nel tubo contenente acqua deionizzata e capovolgere delicatamente per 30 secondi.

Asciugare l'array posizionando i bordi del vetrino su un fazzoletto in tessuto non tessuto. Continuare a ruotare l'array sul fazzoletto, avendo cura di non disturbare il lato contenente gli oligonucleotidi. Posizionare l'array in un tubo conico vuoto e procedere con la scansione dell'array.

Procedere con la scansione dell'array. Di seguito è mostrato un array rappresentativo. Ogni spot o oligonucleotide è colorato in verde per indicare il pool totale non arricchito o in rosso per indicare il pool arricchito tramite immunoprecipitazione (IP).

Il segnale di ogni caratteristica viene normalizzato rispetto all'intensità totale di quel canale. L'output finale è il rapporto logaritmico del canale rosso rispetto al canale verde. Per ogni caratteristica dell'array, il punteggio medio in ogni coordinata genomica viene associato alla posizione specificata.

Un'illustrazione di questo passaggio di media è fornita per tre oligonucleotidi sovrapposti di 30 nucleotidi con punteggi pari a due, quattro e 0,5, in cui viene mostrato il punteggio medio di arricchimento per ogni finestra di 10 nucleotidi. Di seguito è riportato un esempio di schema di legame della proteina legante il poli perine PTB alle caratteristiche del gene CLTA, mostrate lungo il margine inferiore, e i punteggi medi logaritmici di arricchimento per i campioni legati a PTP sono rappresentati da barre verticali rosso scuro. Le barre rosso chiaro indicano le regioni non arricchite per il legame a PTP.

Vi ho appena mostrato come creare rapidamente ed in modo efficiente un pool di oligonucleotidi che ricopre in maniera sovrapposta regioni di interesse, come ad esempio esoni alternativamente splicati. Analizziamo i nostri pool mediante microarray, ma è anche possibile sequenziarli tramite sequenziamento illuminoso, sequenziamento Lexi o sequenziamento Sanger più tradizionale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che la creazione del pool può essere modificata a livello di RNA o di proteina.

A livello di RNA, possiamo introdurre regioni autologhe, mutazioni legate a malattie, polimorfismi o mutazioni casuali nella sequenza dell'oligonucleotide. A livello proteico, il fattore di legame dell'RNA può essere modificato mediante fosforilazione o altre modifiche post-traduzionali. Inoltre, l'ambiente di legame può essere manipolato per aumentare o diminuire i livelli di fattori aggiuntivi che competono con il fattore di legame dell'RNA di interesse o che interagiscono con esso.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.