L'identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Questa procedura inizia col coltivare il ceppo esca in un mezzo contenente aminoacidi normali nel ceppo di controllo SLAC e lisina e arginina marcate con isotopi pesanti. Quantità uguali di entrambi i ceppi vengono mischiate e lisate mediante macinazione in azoto liquido. I lisati grezzi, dapprima pellettizzati per centrifugazione e poi chiarificati tramite legame a sfere di sferos, vengono successivamente legati a sfere di IgG.

Le proteine legate alle perle di IgG vengono eluite mediante proteasi, clivaggiate e precipitate. Il campione è ora pronto per l'analisi mediante spettrometria di massa. Ciao, sono Jesse Chao del Laboratorio Lone del Dipartimento di Biologia Cellulare e Ambientale presso l'Istituto di Scienze della Vita dell'Università della British Columbia.

Oggi vi mostriamo un procedimento per l'analisi proteomica quantitativa chiamato SILAC, abbinato alla purificazione per affinità. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare complessi proteici.

Iniziamo. In questo procedimento, il ceppo esca contiene aminoacidi normali, mentre il ceppo di controllo SLAC contiene lisina e arginina con isotopi pesanti. Per iniziare, coltivare separatamente un litro di ciascun ceppo esca e ceppo di controllo fino al valore indicato sullo schermo. Successivamente, versare la coltura in provette da centrifuga Nalgene da 500 millilitri.

Bilancia il carico nelle cellule del pellet a 2.580 RCF, decanta il mezzo e risospendi il pellet con 50 millilitri di acqua distillata fredda trasferendo le cellule in provette da 50 millilitri. Centrifuga le provette per formare il pellet cellulare a 3.000 RCF. A questo punto, puoi congelare il pellet a -80 gradi Celsius.

È importante ricordare di abbinare la coltura del ceppo di controllo a quella del ceppo esca in rapporto uno a uno in base al peso secco del pellet. Ripesare ogni pellet cellulare in 10 millilitri di buffer NP-40 con un rapporto di 1 a 2000 di cocktail inibitore delle proteasi. Mescolare le due colture cellulari versando direttamente da una provetta all'altra.

Per iniziare la macinazione delle cellule, versare azoto liquido nel mortaio precedentemente raffreddato e lasciarlo evaporare completamente. Successivamente, aggiungere due millilitri di cellule nel mortaio. Versare un po' di azoto liquido per congelare le cellule.

Macina le cellule fino a quando non diventano una polvere fine. Ripeti il processo fino a quando tutte le cellule sono state macinate. Assicurati che le cellule non si scongelino.

Aggiungere azoto liquido quando necessario. Successivamente, trasferire la polvere in un becher freddo di ghiaccio e far scongelare a temperatura ambiente. Quando i bordi iniziano a scongelarsi, aggiungere 20 millilitri di buffer NP-40 con un rapporto di uno a 200 di PIC dopo che è completamente scongelato.

Trasferire il lisato grezzo in provette Nalgene da 40 millilitri e centrifugare a 16.000 giri al minuto in un rotore Sovos SA 600 per 30 minuti. Nel frattempo, prelevare 300 microlitri delle perle SROs due B e lavare le perle con 300 microlitri di tampone NP-40 per tre volte. Successivamente, risospendere le perle in 300 microlitri di tampone in modo da ottenere una sospensione in rapporto uno a uno.

Il passo successivo consiste nel pre-pulire il lisato cellulare. Per fare ciò, trasferire prima il sopranatante in un nuovo tubo e aggiungere le perle Spheros two B. Incubare su una piattaforma rotante in ambiente freddo per 30 minuti.

Durante l'incubazione, prelevare 300 microlitri di SRO IgG contenenti sei perle e lavare le perle tre volte con 300 microlitri di tampone NP-40. Successivamente, risospendere le perle in 300 microlitri di tampone in modo da ottenere una sospensione in rapporto uno a uno. Al termine dell'incubazione, centrifugare gli SRO per formare il pellet.

Due perle nel campione. Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Ricordare di conservare un'aliquote del lisato cellulare per la successiva analisi mediante western blot.

Quindi aggiungere le perle di IgG. Separare il contenuto in due provette per un legame più efficiente, incubare su una piattaforma rotante in una stanza fredda per due ore. Dopo l'incubazione, raccogliere le perle in una colonna cromatografica a quattro gradi Celsius.

Assicurarsi di conservare un'aliquote della frazione non legata. Lavare le perle con 10 millilitri di buffer NP-40.

Successivamente, lavare le perle con tre millilitri di tampone TEVC. Ancora una volta, ricordare di conservare un'aliquote delle perle.

Questo indicherà l'efficienza del legame per eluire le perle. Aggiungere prima cinque microlitri di A-C-T-E-V a un millilitro di tampone TEVC. Aggiungere il tampone TEVC alle perle e mescolare.

Trasferire il contenuto in due tubi EINOR da 1,5 millilitri per un’agitazione più efficiente e incubare su una piattaforma rotante in una stanza fredda durante la notte. Successivamente, centrifugare per far sedimentare le perle e trasferire l’eluato in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Lavare le perle con ulteriori 0,5 millilitri di tampone TEVC dopo il lavaggio.

Unire i otto in un unico tubo. Si dovrebbero avere 1,5 millilitri di ELU otto in totale. Conservare un'aliquote di TEV Elu otto per la precipitazione.

Regolare gli aliquote al 25% di TCA aggiungendo TCA al 100%. Per fare ciò, dividere i 1,5 millilitri di LU otto in due provette da 750 microlitri ciascuna. Aggiungere 250 microlitri di TCA al 100% alla provetta.

La soluzione dovrebbe diventare lattescente. Successivamente, metterla sul ghiaccio per 30 minuti. Vortexare periodicamente la miscela dopo l'incubazione.

Centrifugare alla velocità massima in una centrifuga da banco in una stanza fredda per 30 minuti. Lavare una volta con 500 microlitri di acetone ghiacciato contenente acido cloridrico 0,05 normali. Quindi centrifugare per cinque minuti alla velocità massima a quattro gradi Celsius.

Successivamente, lavare una volta con 500 microlitri di acetone freddo di ghiaccio e centrifugare per cinque minuti alla velocità massima a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione l'acetone e asciugare il pellet per la colorazione argentica. Risospendere il pellet in 50 microlitri di buffer campione SDS una volta.

Se si prevede di utilizzare la proteina precipitata per analisi basate sulla spettrometria di massa, si raccomanda di effettuare la precipitazione utilizzando etanolo. Per fare ciò, aggiungere innanzitutto 20 microgrammi di glicogeno, quindi diluire i campioni di cinque volte con etanolo al cento per cento e portare a 50 millimolari di bicarbonato di sodio utilizzando una soluzione madre 2,5 molare a pH 5,0. Mescolare la soluzione capovolgendo il tubo.

Lasciarlo in riposo per due ore a temperatura ambiente. Infine, dividere il contenuto in due provette eppendorf. Raccogliere la proteina precipitata mediante centrifugazione per 10 minuti a 12.000 ×g a temperatura ambiente.

L'aliquota conservata durante la procedura di purificazione dovrebbe includere il lisato cellulare pre-pulito, la frazione legata, la frazione non legata e la frazione eluita. Si raccomanda di analizzare il contenuto proteico delle suddette aliquote mediante blotting Western utilizzando l'anticorpo anti-TAP o colorazione argentica, al fine di valutare l'efficienza di legame ed eluizione dell'esperimento. In questo gel colorato con argento, SCS purificato con doppio TAP e i suoi partner interagenti sono stati visualizzati e confrontati con un controllo non marcato in questo blotting Western.

Diverse frazioni ottenute durante la purificazione di SCS two tap sono state analizzate mediante immunoblotting utilizzando l'anticorpo Anti-tap. Si noti che SCS two tap ha migrato a un peso molecolare inferiore dopo l'eluizione mediante scissione con la proteasi TEV, e non è rimasto alcun SCS two tap sulle perle di IgG dopo l'eluizione. Ciò ha confermato che la purificazione era altamente efficiente.

È stato appena mostrato come purificare complessi proteici mediante purificazione per affinità con perle IgG. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di abbinare la ceppa base e la ceppa di controllo in base al peso della pastiglia secca prima di iniziare la procedura di purificazione. Poiché LAC ci fornisce misurazioni imparziali e corrette dei partner di legame proteico, eseguiamo soltanto la prima fase della purificazione TAP per minimizzare la perdita di campione.

Se si verifica un elevato grado di legame aspecifico, si consiglia di eseguire l'intero protocollo, disponibile nel manuale di cold springing harbor. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

Ehi, andiamo, Mark. Ah, vai.