Identificazione di complessi proteici in

L'obiettivo di questo esperimento è identificare proteine, interazioni proteiche e la composizione delle subunità di complessi MultiPro nativi provenienti da *E. coli*. Questo viene ottenuto amplificando prodotti PCR lineari specifici per sequenza, che codificano il marcatore SPA e un marcatore selezionabile, i quali vengono integrati ed espressi in quadro di lettura come fusioni a livello del carbossiterminale in un ceppo *ddy 3,3 0*, utilizzando il sistema di ricombinazione batterica Fage lambda. Successivamente, viene effettuata una purificazione in due passaggi mediante perle di affinità a base di cow modlin e Anti-Flag per recuperare in modo efficiente complessi proteici presenti a bassa abbondanza. In seguito, le proteine legate, eluite con buffer di eluizione cow modlin o CEB, vengono digerite con tripsina e analizzate mediante spettrometria di massa per l'identificazione proteica.

I risultati ottenuti mostrano che le diverse subunità dell'enzima RNA polimerasi core, inclusi i fattori di terminazione della trascrizione e i fattori anti-determinazione, sono state co-purificate in modo efficiente con la subunità D dell'RNA polimerasi marcata, indicando che i nuovi componenti associati possono essere individuati efficacemente utilizzando questo approccio. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà nelle due fasi di purificazione ad affinità, nelle quali un'accurata lavorazione dei lisati cellulari con opportune soluzioni tampone è assolutamente necessaria per garantire il successo nel recupero efficiente di complessi con bassa e alta abbondanza a partire da colture su larga scala. A dimostrare le procedure di purificazione ad affinità e di spettrometria di massa saranno Olga Kagan e HBO guo, due tecnici del mio laboratorio. Questo protocollo inizia con il targeting di sequenze specifiche amplificate nel ceppo DDY tre 30, in cui la macchinaria di ricombinazione Lambda red è espressa come descritto nel protocollo scritto.

Successivamente, coltivare il ceppo esprimente il sistema di ricombinazione batterico Lambda in due millilitri di terreno Luria bati o terreno LB a 32 gradi Celsius per tutta la notte, agitando a 180 giri al minuto. Il giorno seguente, inoculare un millilitro della coltura ottenuta dopo la notte in 70 millilitri di terreno LB fresco contenuto in un matraccio conico da 500 millilitri. Far crescere l'inoculo a 32 gradi Celsius agitando a 180 giri al minuto fino a quando l'OD 600 raggiunge un valore di circa 0,8. Indurre le cellule incubando il matraccio in un bagno termico a 42 gradi Celsius, agitando delicatamente a 180 giri al minuto per 15 minuti.

Immediatamente dopo l'induzione, incubare il pallone in un bagno di ghiaccio e acqua per almeno 30 minuti con agitazione. Dopo aver raccolto e lavato le cellule come descritto nella procedura scritta, sospendere il pellet cellulare in 700 microlitri di acqua sterile, fredda di ghiaccio, ottenendo cellule elettrocompetenti mediante elettroporazione. Introdurre un microlitro dell'amplificato purificato in 40 microlitri di cellule elettrocompetenti.

Le cellule vengono elettroporate dopo il ricombinamento omologo e l'integrazione. I trasformanti che hanno ricombinato con successo il tag o il cassette nel cromosoma vengono selezionati in base alla resistenza alla canamicina; selezionare più trasformanti per la blotting western al fine di verificare la corretta generazione delle proteine di fusione marcate SPA mediante l'anticorpo Anti-Flag M2, specifico per gli epitopi Flag del tag SPA. Trasferire 10 millilitri della coltura notturna in 990 millilitri di terreno tb fresco, integrato con 25 microgrammi per millilitro di canamicina, in un matraccio da quattro litri.

Coltivare la coltura a 32 gradi Celsius con agitazione costante a 250 giri al minuto per cinque-sei ore fino a quando l'OD 600 raggiunge un valore compreso tra 2 e 3. Trasferire la coltura di E. coli SPA tag di un litro in bottiglie pulite per centrifuga e centrifugare le cellule a 4 gradi Celsius e 3.993 ×g per 15 minuti. Dopo aver risospeso le cellule come descritto nel protocollo scritto.

Trasferire i campioni in un bicchiere sterile in acciaio inossidabile posto sul ghiaccio per la sonificazione. Immergere la sonda nel campione e sottoporlo a sonificazione per tre minuti. Al termine della sonificazione, lasciare raffreddare ulteriormente il campione per due minuti per evitare il surriscaldamento, successivamente alla centrifugazione del lisato sonicato.

Trasferire con attenzione il sopranatante S dal tubo di centrifugazione a un tubo falcon in polipropilene da 50 millilitri. Congelare il campione utilizzando azoto liquido e conservare l'estratto cellulare sonicato congelato per un periodo massimo di sei mesi a meno 80 gradi Celsius per utilizzi futuri. Per iniziare la purificazione per affinità dell'estratto cellulare sonicato congelato, porre il tubo in acqua fredda e incubare l'estratto cellulare TH con tre microlitri di benzo, una nucleasi, per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

A questa miscela, aggiungere il detergente non ionico Triton X-100 e 200 microlitri di sospensione di perle agro di Anti-Flag M2. Mescolare delicatamente il contenuto ruotando il tubo per tre ore a quattro gradi Celsius. Dopo tre ore di rotazione, centrifugare il tubo a 1.700 ×g per sei minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere con attenzione la maggior quantità possibile del surnatante senza disturbare il pellet allentato.

Sospendere nuovamente il pellet nel SNA rimanente e quindi trasferirlo in una colonna preparativa in polipropilene. Rimuovere i tappi dell'uscita inferiore della colonna per consentire al eluato di defluire per gravità. Successivamente, lavare la colonna cinque volte con 200 microlitri di buffer FC 1x e procedere con la scissione mediante TEV come descritto nel protocollo scritto.

Dopo la scissione, chiudere rapidamente sia la parte superiore che quella inferiore della colonna. Mescolare delicatamente il contenuto della colonna mediante rotazione durante la notte a quattro gradi Celsius dopo la rotazione notturna. Svuotare l’eluito rimuovendo il tappo superiore e il tappo inferiore nella nuova colonna.

Lavare la colonna usata con 400 microlitri di buffer di legame Cal Modlin 1x e 150 microlitri di sospensione di perline di legame Cal Modlin. Eluere la proteina legata in quattro frazioni da 50 microlitri ciascuna in una nuova provetta eppendorf. Utilizzando buffer di eluizione Cal Modlin 1x.

Distribuire la frazione eluita in due provette eppendorf pulite in volumi uguali. Successivamente, asciugare i contenuti di entrambe le provette utilizzando un evaporatore sotto vuoto. L'eluito essiccato proveniente da una provetta viene utilizzato per eseguire un gel con colorazione argentica come descritto nel testo, mentre l'altro viene conservato a meno 80 gradi Celsius.

Per un uso futuro in spettrometria di massa sul campione essiccato, aggiungere 50 microlitri di tampone di digestione e 0,9 microlitri di tris fosfina cloridrato 100 millimolari; incubare la miscela per 45 minuti a temperatura ambiente per la fase di riduzione. Successivamente, aggiungere un microlitro di IDO acetammide 500 millimolari e incubare al buio per altri 40 minuti per consentire l’alchilazione del campione. Dopo il secondo ciclo di incubazione, aggiungere un microgrammo di trips nella miscela. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per cinque ore oppure a temperatura ambiente per tutta la notte, a seconda dell’incubazione.

Assicurarsi di arrestare la reazione aggiungendo un microlitro di acido acetico. Quindi preparare la Millipore zip tip, la punta pipetta come descritto nel testo per un legame efficiente del peptide alla punta. Mescolare la miscela di peptide 20 volte e rimuovere la miscela di peptide che si è legata alla punta aspirando e dispensando la soluzione di lavaggio.

Ripetere questa procedura due volte per un'efficace legatura della miscela peptidica alla punta contenente il peptide legato. Aspirare 10 microlitri della soluzione di bagnamento e di equilibrazione ed espellere in una provetta pulita. Ripetere questo passaggio due volte.

Dopo aver essiccato i campioni eluiti in un vuoto accelerato, i campioni possono essere analizzati immediatamente mediante spettrometria di massa oppure conservati a meno 80 gradi Celsius prima dell'uso. Le micro colonne utilizzate in questo procedimento sono riempite con circa 10 centimetri di resina C18 lunare da tre micron e sono collegate a una sorgente di ionizzazione nano elettrospray Pro Zion posizionata in linea con lo strumento orbitrap. Per garantire un flusso stabile alla punta di circa 300 nanolitri al minuto durante le separazioni dei peptidi, al fine di ottenere la diluizione dei peptidi e impostare un gradiente di tampone organico in base alla complessità del campione, si utilizza una pompa HPLC binaria a flusso nano Pro Zion.

Per questo campione di SPA di e coli, la fase mobile A contiene il 95% di acqua per gradiente HPLC e il 5% di acetonitrile con lo 0,1% di acido formico, mentre il solvente B contiene il 5% di acqua per gradiente HPLC e il 95% di acetonitrile con lo 0,1% di acido formico. Successivamente, cercare gli spettri mediante uno strumento di spettrometria di massa utilizzando un algoritmo di ricerca in banca dati come Seaquest, confrontandolo con una banca dati di sequenze proteiche di e coli. Filtrare statisticamente i risultati mediante un algoritmo probabilistico come StarQuest per garantire un basso tasso di falsa scoperta. Sia il fattore sigma della RNA polimerasi marcate con SPA sia la proteina YakLA, di funzione sconosciuta, si sono purificate congiuntamente in modo specifico con l'enzima RNA polimerasi core, comprensivo delle subunità alfa, beta e beta prime, nonché con il fattore di riciclo della RNA polimerasi. In contrasto con il fattore sigma della RNA polimerasi marcato, YakL si è legato inoltre a un fattore anti-determinazione essenziale per la terminazione della trascrizione, suggerendo una funzione specializzata nel processo di trascrizione.

Sono state inoltre rilevate mediante LCMS diverse altre proteine più piccole che co-purificavano, non evidenti sul gel, tra cui la subunità Omega della RNA polimerasi e fattori di trascrizione, terminazione e determinazione USA e NUSD. Al contrario, in un esperimento indipendente, il complesso di mobilitazione dello zolfo, etichettato, S-U-F-B-S-U-F-C e SUFD, ha co-purificato reciprocamente, indicando una partecipazione congiunta nella biosintesi dei cluster ferro-zolfo come un unico complesso di tipo scaffold. Questo esempio rappresentativo evidenzia come complessi batterici MultiPro precedentemente ben studiati e altamente annotati, coinvolti in processi biologici essenziali, possano spesso presentare componenti associati inediti che possono essere identificati in modo efficiente.

Utilizzando questo approccio, il basso numero di copie della proteina SUFB potrebbe aver determinato un'intensità del segnale debole rispetto all'intensità elevata osservata negli esperimenti di pull-down di SUFC e SUFD per definire la composizione di complessi proteici multi-unità stabili; a tali interazioni sono stati assegnati punteggi di co-purificazione per identificare quelle ad alta confidenza, tenendo conto dell'unicità delle relazioni esca-prede, esca-esca e preda-prede. Successivamente, mediante procedure di clustering su grafi come l'algoritmo di clustering markoff, vengono identificati cluster proteici distinti a partire dalla rete probabilistica di interazioni proteina-proteina suddivisa.

Le reti di interazione putative possono essere visualizzate utilizzando cyto scape. Combinando dati di proteomica con ulteriori evidenze di associazione funzionale ricavate mediante metodi genomici, è possibile indagare nuovi ruoli meccanicistici di proteine di e coli precedentemente annotate. Qui, subnet di complessi proteici e moduli funzionali che partecipano come quartieri funzionali più ampi sono state definite in e coli.

L'analisi principale di cluster gerarchico di Graham mostra i modelli di previsioni funzionali e le annotazioni esistenti per i geni orfani dal punto di vista funzionale e per quelli caratterizzati di e coli; i colori giallo e blu rappresentano rispettivamente le funzioni esistenti e quelle dedotte, mentre le diverse intensità di tonalità indicano i punteggi di confidenza. I processi biologici associati a vari intorni sono indicati a destra; gli insetti mostrano le singole componenti di un intorno rappresentativo, basati sui punteggi di similarità della rete integrata di interazioni fisiche e funzionali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come i complessi proteici stabili di estia Coli possano essere isolati mediante l'approccio di purificazione per affinità abbinata a spettrometria di massa.

In linea di principio, questa tecnica può essere applicata per caratterizzare complessi di proteine di membrana o complessi proteici di qualsiasi altra specie per cui sia possibile la ricombinazione.