Antivegetativa monostrati auto-assemblati su microelettrodi per Biomolecole Patterning

Questa procedura inizia con la fabbricazione di un microelettrodo su un substrato di silicone. Viene formato un monolivello autoassemblato di polietilene glicole sul microelettrodo e sul substrato per prevenire l'incrostazione da microtubuli. Successivamente vengono preparati microtubuli marcati con rumina.

Infine, i microtubuli vengono disposti sugli elettrodi trattati mediante elettroforesi. Ciao, sono John Noel del Nana Lab del Dipartimento di Fisica e del Laboratorio di Biomeccanica Molecolare del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Texas A&M University. Sono Wil free Teza del Dipartimento di Fisica e direttore del Center Skill Science and Technology della Texas A&M University.

E io sono Juan Quang, direttore del Laboratorio di Biomeccanica Molecolare del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per la fabbricazione di microelettrodi rivestiti con un monolivello autoassemblato non aderente. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare il palleggio di microtubi mediante elettroforesi.

Iniziamo. Per cominciare, utilizzare uno scriba o un taglierino per wafer per tagliare i wafer di silicio in pezzi di un centimetro per 1,5 centimetri da utilizzare come substrati. Pulire ora i substrati ponendoli in un becher con acetone in quantità sufficiente a coprirli e sottoporli a sonificazione per cinque minuti senza permettere ai substrati di asciugarsi.

Sciacquarli con acetone fresco e quindi risciacquarli immediatamente con isopropanolo, asciugandoli successivamente con azoto. Utilizzando una litografia fotolitografica in tono positivo standard o una litografia a fascio di elettroni, realizzare microelettrodi d'oro sui substrati puliti. Quando si progetta la geometria del pattern, mantenere il diametro di ciascun elettrodo al di sotto di 100 micron. Per garantire la copertura da parte del monolayer autoassemblato di trimetossil silano polietilene glicole (Peg Sam), includere pad di contatto posizionati tra 300 e 500 micrometri dal pattern, con una linea di un millimetro che collega il pad all'elettrodo.

Dopo lo sviluppo del pattern nello strato di resist, utilizzare una pinzetta per tracciare una linea nel resist dal pad di contatto fino al bordo del substrato. Durante la deposizione del metallo, il graffio permetterà il contatto elettrico tra l'elettrodo e il bordo del substrato. Si utilizza una camera di deposizione, preferibilmente con due sorgenti, per depositare lo strato metallico.

Gli elettrodi vengono formati mediante deposizione di due nanometri di cromo, seguita da sei nanometri di oro. Senza rompere il vuoto, si può utilizzare un microbilancio a cristallo di quarzo montato all'interno della camera per misurare lo spessore dei film durante la deposizione. Possiamo ora iniziare a preparare il monolivello autoassemblato in un'area ben ventilata, preriscaldando un forno a 75 gradi Celsius. Preparare la soluzione di silanizzazione aggiungendo un millilitro di peg silane a 20 millilitri di toluene in un becher di vetro da 250 millilitri.

Mescolare bene aspirando e dispensando con la pipetta da cinque a dieci volte, quindi agitare con la pipetta per 30 secondi. Posizionare i campioni del motivo nel becher con il lato del motivo rivolto verso l'alto, assicurandosi che siano completamente immersi nella soluzione e uniformemente distanziati sul fondo del becher. Collocare il becher nel forno e cuocere per 18-21 ore mentre avviene la formazione del Sam.

Preparare l'elettrodo contatore depositando un nanometro di cromo seguito da quattro nanometri di oro su un'ampolla di vetro di 22 per 50 millimetri. L'elettrodo contatore deve essere quasi trasparente con una leggera tinta grigia o rosa. Conservare l'elettrodo contatore con il lato rivestito rivolto verso l'alto in una piastra di Petri per mantenerlo pulito.

Dopo 18-21 ore in forno, rimuovere il becher dal forno. Il toluene dovrebbe essere evaporato, lasciando i campioni di stampo in un residuo viscoso di peg cline. Aggiungere 20 millilitri di toluene nel becher e lasciare in ammollo i campioni per uno-due minuti.

Rimuovere i campioni dal becher e sciacquarli con toluene, quindi con isopropanolo e infine asciugarli con azoto. A questo punto, i campioni dovrebbero apparire puliti e lo strato di Sam dovrebbe essere invisibile ad occhio nudo. I campioni preparati in questo modo possono essere utilizzati fino a due giorni se conservati in condizioni fresche e asciutte.

Una formazione non riuscita di Sam produce un residuo opaco o con colorazione irregolare che ricopre la superficie. Una volta preparati i Sam, possiamo iniziare la polimerizzazione della tubulina in microtubuli. Iniziare scongelando la tubulina non marcata e la tubulina marcata con r domine, quindi combinarle immediatamente in un rapporto di due a uno, rispettivamente non marcata a marcata, per ottenere microtubuli luminosi.

Miscelarli accuratamente aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Successivamente, polimerizzare la tubulina per 20-40 minuti in un bagno termico a 37 gradi Celsius mentre la tubulina è in fase di polimerizzazione. Preparare un buffer pipes Taxol mescolando 20 micromolare di Taxol con buffer pipee.

Mescolare accuratamente aspirando e dispensando più volte con una pipetta e agitando con un vortex, quindi inserire il tubo nel bagnomaria a 37 gradi Celsius. Dopo la polimerizzazione, diluire i microtubuli in tampone Taxol tiepido e proteggerli dalla luce. Verificare che la polimerizzazione dei microtubuli sia avvenuta con successo e che i microtubuli siano stabili durante diversi minuti di eccitazione in fluorescenza.

Immagini i microtubuli preparati in presenza di una miscela che elimina l'ossigeno, con la polimerizzazione della tubulina in microtubuli completata. Iniziamo a definire il modello dell'MTS mediante elettroforesi. Per cominciare, tagli una striscia di nastro adesivo doppio lato in strisce sottili posizionandola su un vetrino e utilizzando una lametta; quindi posizioni due strisce di nastro adesivo doppio lato attraverso il campione rivestito con Sam e strutturato, in modo che l'elettrodo si trovi tra le strisce e il percorso di collegamento sia perpendicolare al nastro.

Posizionare l'elettrodo contatore sul nastro adesivo bifacciale con il lato metallico a contatto con il nastro, in modo che il bordo del campione sporga di circa tre millimetri rispetto all'elettrodo contatore. Tagliare diverse lunghezze di filo di rame smaltato isolate di 15 centimetri e rimuovere un centimetro di isolamento da entrambe le estremità. Utilizzare una piccola goccia di vernice argentata per fissare un filo alla zona d'oro esposta del substrato, avendo cura di evitare contatti elettrici con l'elettrodo contatore.

Ora utilizzare la vernice argentata per collegare un secondo filo al contatore. I fili dell'elettrodo fissati con vernice argentata possono essere ulteriormente assicurati ai campioni con del nastro. Successivamente, mediante pipetta, introdurre i microtubuli al grado di diluizione desiderato, osservare l'immagine a 20x di ingrandimento e individuare il disegno sul wafer di silicio prima di applicare una tensione.

A causa della profondità della camera di flusso, potrebbero essere necessari obiettivi con lunga distanza di lavoro per immaginare la superficie superiore della camera di flusso. La distanza tra la superficie del campione e la superficie superiore della camera di flusso è determinata dallo spessore del nastro e dovrebbe essere compresa tra 60 e 100 micrometri. Applicare una tensione fino a un volt e osservare la migrazione dei microtubuli.

Se si desidera un intrappolamento reversibile dei microtubuli, utilizzare lo smalto per unghie per sigillare la camera di flusso ed evitare spostamenti laterali, e usare tensioni più basse fino a circa 0,5 volt. La migrazione può essere monitorata regolando il piano verticale di messa a fuoco del microscopio con tensioni applicate comprese tra circa 0,9 e 1,2 volt, condizione in cui i microtubuli si localizzano sulle superfici degli elettrodi.

Un voltaggio più elevato renderà la migrazione più rapida e l'adesione più forte, ma un voltaggio eccessivo indurrà elettrolisi e depolimerizzazione. Microtubuli: vi abbiamo appena mostrato come preparare microelettrodi rivestiti con SAM per la creazione di schemi di MT, poiché il rivestimento SAM impedisce l'assorbimento dei microtubuli sui microelettrodi. Questa procedura può essere utilizzata anche per la creazione reversibile di schemi di microtubuli.

Inoltre, questo processo non è limitato solo ai microtubuli, ma può essere utilizzato anche per definire schemi di biomolecole in generale. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.