La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un substrato strutturato in due dimensioni per il controllo dell'assorbimento proteico e della crescita cellulare. Questo risultato si ottiene utilizzando la fotolitografia per fabbricare un master strutturato, che viene impiegato per produrre uno stampo in A-P-D-M-S per la stampa per contatto microscopico. Come secondo passaggio, si prepara il substrato d'oro strutturato, che prevede la stampa per contatto microscopico per generare un pattern con aree che assorbono e resistono all'adsorbimento proteico.

In seguito, proteine e cellule vengono aggiunte al substrato per visualizzare il disegno e condurre lo studio. Si ottengono risultati sulla crescita e sul comportamento cellulare che mostrano un buon confinamento di proteine e cellule su questi substrati stampati, basati su microscopia a fluorescenza e contrasto di fase. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come la stampa MicroCon di proteine, è che il monolayer terminato con gruppi glicolici resiste all'assorbimento non specifico di proteine e cellule nello sfondo del disegno.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché la tecnica di stampa deve essere ottimizzata per ogni motivo stampato. Per iniziare la preparazione del centro master strutturato, posizionare la wafer di silicio sullo spin coater e, durante il primo passaggio del programma di centrifugazione a due cicli, risciacquare la wafer con acetone. Durante il secondo passaggio del programma di centrifugazione, l'acetone evaporerà, lasciando una wafer pulita e asciutta all'inizio della centrifugazione; applicare quindi il photoresist sulla wafer e rivestirla mediante spin coating utilizzando le condizioni descritte in precedenza.

Effettuare una cottura leggera della wafer rivestita con photoresist a 110 gradi Celsius per due minuti utilizzando una piastra riscaldante ad alta uniformità. Successivo passo di fotolitografia. La wafer rivestita con photoresist viene esposta mediante un sistema di allineamento della maschera e una maschera appropriata.

Posizionare innanzitutto il substrato sul carrello a vuoto del mask aligner. Inserire quindi la maschera nel vassoio del supporto e attivare il vuoto per fissare la maschera in posizione, verificando un buon contatto tra la maschera e il substrato. Sollevare il substrato fino a farlo aderire alla maschera.

Utilizzare l'ottica dell'allineatore per verificare che sia stato stabilito un buon contatto. Infine, accendere la lampada per esporre il substrato alla luce UV attraverso la maschera litografica. Sviluppare la pastiglia strutturata nel revelatore per un minuto e 45 secondi con agitazione delicata.

Sciacquare accuratamente con acqua deionizzata di grado semiconduttore ed asciugare con un flusso di gas azoto; verificare lo sviluppo del pattern utilizzando un microscopio dotato di filtro UV. Iniziare questa procedura preparando una miscela di resina e indurente in rapporto ponderale di 10 a 1. Mescolare completamente il Cigar 180 2.

Coprire la wafer con il pattern fotografico con la miscela in una capsula di Petri monouso in un essiccatore sotto vuoto per eliminare le bolle d'aria, fino a quando non saranno più visibili bolle nel master ricoperto di PDMS. Dopo aver verificato che il master si trovi sul fondo della capsula, lasciare polimerizzare il timbro in un forno a 65 gradi Celsius per 1,5 ore. Una volta che il timbro in PDMS è polimerizzato, staccarlo dal master e tagliarlo alle dimensioni appropriate.

Conservare il timbro in un contenitore coperto con la superficie funzionale rivolta verso l'alto per proteggerlo da polvere e detriti. Per preparare i substrati per la deposizione del metallo, trattare prima delle rondelle di vetro rotonde con plasma di ossigeno per 10 minuti. Quindi risciacquare le rondelle due volte con acqua deionizzata, asciugandole con un flusso di gas azoto tra i risciacqui; dopo il risciacquo con acqua, risciacquare due volte con etanolo, asciugando nuovamente con un flusso di gas azoto tra i risciacqui.

Utilizzando un sistema di deposizione a fascio di elettroni multipocket, depositare 50 angstrom di titanio seguiti da 150 angstrom di oro. Non effettuare la ventilazione dell'evaporatore tra il deposito dello strato di titanio e quello di oro. Risciacquare il timbro in PDMS con etanolo ed essiccare accuratamente.

Con gas azoto, applicare la soluzione di stampa sulla matrice goccia a goccia fino a quando non è completamente ricoperta. Asciugare accuratamente la matrice con gas azoto. La stampa per contatto microscopica del file di HEXA Decano dipende dalle caratteristiche della matrice in PDMS ed è uno degli aspetti più difficili di questa procedura.

Per una stampa corretta è necessario sviluppare una buona tecnica che applichi una pressione uniforme durante la stampa. Per la microstampa per contatto convenzionale in aria, premere delicatamente il timbro sul substrato d'oro e lasciare formare il monolayer per 15 secondi.

In alternativa, per schemi costituiti da caratteristiche molto piccole e rapporti d'aspetto elevati, posizionare il substrato d'oro in una piastra di Petri contenente acqua deionizzata da 18,2 mega ohm, assicurandosi che il substrato sia completamente immerso. Successivamente, premere delicatamente il timbro sul substrato d'oro e lasciare formare il mono strato per 15 secondi. Quindi, risciacquare il substrato timbrato due volte con etanolo ed essiccare con gas azoto.

Dopo ogni risciacquo, posizionare il substrato in una piastra di Petri e coprirlo con la soluzione di riempimento. Sigillare la piastra con del para per prevenire l'evaporazione. Lasciare formare il monostato di fondo al buio per 12-14 ore.

Infine, rimuovere il coverslip stampato dalla soluzione di riempimento posteriore e risciacquare due volte con etanolo, asciugando con gas azoto dopo ogni risciacquo. Per applicare la proteina sul coverslip stampato, posizionare il coverslip in una piccola capsula di Petri o in una camera per colture cellulari e coprire con 500 microlitri fino a un millilitro di soluzione salina tamponata al fosfato di delcos. Il DPBS deve coprire completamente il substrato durante l'incubazione con la proteina.

Per garantire una distribuzione uniforme della proteina, aggiungere una soluzione concentrata di proteina al DPBS e mescolare la soluzione mediante pipettaggio ripetuto. Incubare la miscela proteica con il substrato a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, risciacquare accuratamente il substrato con DPBS per rimuovere la proteina non legata, avendo cura di non far asciugare il substrato né di farlo passare attraverso l'interfaccia aria-acqua.

Dopo tre risciacqui, aspirare il DPBS. Quindi aggiungere circa 500 microlitri di mezzo di crescita cellulare completo per mantenere un substrato umido. Sostituire il mezzo di crescita utilizzato per risciacquare il substrato.

Con del mezzo fresco, il substrato è ora pronto per la semina delle cellule. Solitamente vengono seminate da 30 a 200 cellule per millimetro quadrato sul substrato. Questa immagine mostra il timbro A-P-D-M-S visualizzato al microscopio posizionando la superficie strutturata del timbro rivolta verso il basso su un coprioggetto di vetro; la barra della scala è di 100 micrometri.

Una stampa corretta produce un motivo proteico nitido e ben definito, visualizzabile mediante l'applicazione di una proteina marcate con fluorocromo, come la fibronectina marcata con LOR 6 47. Qui viene mostrato il confinamento delle chk one cells al motivo proteico. Le barre della scala misurano 100 micrometri in queste immagini.

In alternativa, l'immunocitochimica può essere utilizzata per visualizzare il pattern proteico dopo la fissazione con SU. In questo caso, viene utilizzato l'anticorpo anti-lamina coniugato LOR tre 50 per visualizzare la lamina stampata con neuroni ippocampali di topo E 18, mostrati a quattro giorni in vitro. Neuroni ippocampali di topo E 18 colorati con MIT tracker red cinque 80 mostrano che la crescita cellulare è ben confinata al pattern proteico. Sebbene questa tecnica sia facilmente apprendibile, possono insorgere diversi problemi comuni, come illustrato da queste preparazioni di substrati stampati visualizzate mediante assorbimento di fibronectina coniugata LOR sei 47.

L'applicazione della proteina senza un'adeguata miscelazione della soluzione proteica concentrata nel DPBS può portare a schemi proteici irregolari. Un'incubazione impropria può causare un trasferimento parziale dello schema o il collasso del timbro. Inoltre, l'esposizione del substrato con proteina assorbita all'aria può alterare il monolayer, provocando una riduzione della resistenza.

In background, il patterning sommerso può produrre schemi con caratteristiche di piccole dimensioni che risultano difficili da stampare mediante microcontatto convenzionale e in aria. Queste due immagini mostrano diverse regioni dello stesso schema stampato con lo stesso timbro in PDMS, in aria o in acqua deionizzata; le linee di supporto sono mostrate nell'immagine a sinistra per dimostrare che solo le caratteristiche più piccole dello schema non sono state stampate con successo. Le barre della scala corrispondono a 20 micrometri. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 18-24 ore se realizzata correttamente.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare un substrato con un modello. Produrre un timbro A-P-D-M-S. Utilizzare la microstampa per contatto per preparare un substrato d'oro con un modello e visualizzare tale modello mediante proteine e cellule.