Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila

Verranno presentate qui due tecniche per la visualizzazione di un cuore in battito in Drosophila per la dissezione del cuore adulto. Innanzitutto, la testa e il torace vengono rimossi con un singolo taglio lungo la linea indicata. Successivamente, vengono rimossi gli organi genitali e la cavità addominale viene aperta utilizzando pinzette; vengono quindi rimossi l'intestino e, nel caso di una mosca femmina, anche le ovaie.

Il tessuto adiposo addominale nei segmenti addominali tre e quattro viene delicatamente aspirato per esporre il cuore adulto al fine di immobilizzare il cuore larvale. Una singola larva posizionata in soluzione tampone viene fissata applicando prima una colla istoacrilica attorno alla regione cefalica della larva. La larva viene delicatamente stirata e ulteriore colla viene applicata all'estremità posteriore e poi ai lati della parete corporea della larva.

Ciao, sono GI Fler. Ciao, sono Karen er. Entrambi facciamo parte del programma di Sviluppo e Invecchiamento presso l'Istituto Burnham per la Ricerca Medica.

Oggi vi mostreremo le procedure che abbiamo sviluppato per visualizzare il cuore in battito di Drosophila allo stadio larvale e adulto. Utilizziamo entrambi questi preparati come metodo per visualizzare, esaminare e quantificare i parametri del battito cardiaco nella mosca della frutta, Drosophila. Prima di iniziare, prepariamo innanzitutto una soluzione artificiale di emolinfa.

Questa soluzione contiene l'ingresso di saccarosio, helo, che deve essere aggiunto all'emolinfa artificiale proveniente da soluzioni madri refrigerate appena prima dell'uso. Per prevenire contaminazioni batteriche, portare l'emolinfa artificiale a temperatura ambiente e ossigenare la soluzione mediante bollicine d'aria per almeno 15 minuti. Successivamente, preparare diverse capillari sottili utilizzando un estrattore standard per pipette, che saranno necessarie per la rimozione dei corpi adiposi nella mosca.

Dopo aver preparato tutto, i moscerini adulti devono essere anestetizzati. Questo può essere fatto esponendoli brevemente al gas anestetico per due-cinque minuti, ma è necessario fare attenzione a non lasciare i moscerini nel gas anestetico per più di cinque minuti. Anche un'esposizione a breve termine al freddo può essere utilizzata per anestetizzare i moscerini, ma non si consiglia l'anidride carbonica poiché ha effetti persistenti sulla frequenza cardiaca e sulla motilità.

Successivamente, le mosche anestetizzate vengono posizionate con il lato dorsale verso il basso in una piastra di Petri rivestita con uno strato sottile di vaselina. La cuticola idrofoba delle ali e del corpo dovrebbe aderire in modo reversibile alla vaselina, ma la mosca può essere riposizionata se necessario. Viene effettuato un taglio iniziale utilizzando un paio di forbici a molla curve.

Questo viene fatto posizionando le lame delle forbici sotto le zampe della mosca e inclinandole verso il basso, in direzione della superficie dorsale vicino al collo. Il cordone nervoso ventrale della testa e le zampe vengono rimossi con un singolo taglio. Il preparato viene quindi immerso nella soluzione artificiale di emo-linfato ossigenata utilizzando forbici a molla.

Il margine posteriore dell'addome, costituito dal settimo e dall'ottavo segmento addominale, viene rimosso con un singolo taglio. Questo permette di effettuare tagli laterali lungo entrambi i bordi dell'addome e serve a interrompere la connessione tra l'intestino posteriore e la cuticola addominale. Inserire le lame delle forbici nella piccola apertura situata all'estremità dell'addome e tagliare lateralmente la cuticola.

Questo libera un margine del cuticolo ventrale. Afferrare la linguetta con una pinzetta ed eseguire un taglio simile lungo il margine laterale opposto dell'addome. La linguetta libera del cuticolo addominale ventrale può ora essere rimossa.

Gli organi addominali, inclusa l'intestino, possono generalmente essere rimossi come un'unica massa utilizzando pinzette da orafo ed esercitando un leggero strappo. La rimozione degli organi interni rivela il tubo cardiaco in battito, che è ancora attaccato alla cuticola dorsale mediante piccoli muscoli arteriosi ed è circondato da corpi adiposi. I capillari estratti vengono inseriti in un tubo di plastica di un sedicesimo di pollice, collegato a una fonte di vuoto.

La forza di aspirazione è proporzionale al diametro della punta, quindi non si devono utilizzare pipette con punte di diametro superiore a 40 micron una volta predisposte. Questo sistema di aspirazione serve per rimuovere il grasso in eccesso attorno al tubo cardiaco. Può essere utilizzato anche per eliminare le bolle d'aria che si accumulano attorno alla cuticola e qualsiasi detrito.

È necessario prestare la massima attenzione per evitare di toccare direttamente il cuore; poiché la porzione posteriore del cuore è molto fragile, anche questa regione deve essere evitata. Il tubo cardiaco dell'adulto di drosophila è ora esposto e, se necessario, dovrebbe essere in attività contrattile. La cuticola e il cuore ad essa aderente possono essere riposizionati sollevando delicatamente la cuticola dalla gelatina di petrolio e premendola con attenzione nuovamente verso il basso.

Evitando qualsiasi contatto con il tessuto cardiaco. A questo punto, la soluzione in cui è immersa la preparazione deve essere sostituita con emolinfa artificiale fresca. Si deve permettere a questa preparazione di equilibrarsi per 20-30 minuti con ossigenazione prima di qualsiasi manipolazione.

Se la preparazione deve essere mantenuta per più di 60 minuti, va ripristinata con emolinfa artificiale fresca. Questa preparazione è ora pronta per essere utilizzata per la registrazione ottica e può anche essere impiegata per registrazioni elettrofisiologiche o per manipolazioni istologiche. È richiesta una tecnica diversa per visualizzare il cuore in battito all'interno dei larve.

Preparare innanzitutto le lamelle il giorno precedente la procedura. Per farlo, utilizzare uno stuzzicadenti per trasferire circa 50-70 microlitri di soluzione Sard su una lamella di 22 per 22 millimetri. Lasciare indurire il syl guard a 65 gradi Celsius durante la notte.

Successivamente, preparare il buffer di Brody e Bates; una volta preparato, gli aliquote possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius e scongelati all'occorrenza. Infine, preparare gli strumenti necessari per applicare la colla isto acrale. Per prima cosa, tirare parecchie capillari fini.

Successivamente, collegare una punta da pipetta da 1,5 millilitri a un tubicino di plastica di circa un trentaduesimo di pollice di diametro. Inserendo l'estremità più piccola nel tubicino, collegare un capillare con l'apertura larga all'altra estremità. Una volta assemblato, caricare il capillare con colla istologica immergendo l'estremità del capillare in una goccia di colla ed esercitando una leggera aspirazione attraverso la punta di plastica.

Quando si lavora con la colla, è consigliabile avere a disposizione una seconda capillare di vetro per rimuovere l'eccesso di colla dalla punta della capillare contenente la colla. La colla è liquida finché non entra in contatto con soluzione salina tamponata, nella quale si indurisce entro pochi secondi. Tuttavia, di solito rimane plastica abbastanza a lungo da poter essere rimossa dalla punta della capillare o mentre viene applicata al campione.

Ora, per iniziare l'immobilizzazione delle larve, posizionare una goccia di colla istologica acrilica vicino a ciascun angolo del syl guard. Aggiungere coprioggetti e 50 microlitri di buffer B e B sulle gocce di colla, che si induriranno immediatamente; riempire lo spazio tra i punti incollati con B e B. La colla manterrà il buffer sul vetrino.

Prendere tre larve di L in movimento e posizionarle su un pezzo di carta assorbente bagnata posta sul ghiaccio per due minuti. Questo rallenterà il loro movimento. Successivamente, trasferire le larve nel buffer e orientarle con il lato dorsale rivolto verso l'alto.

Questo è il lato delle larve che non presenta le cinture identiche. Applicare rapidamente un po' di colla tra la regione cefalica e la guarnizione della soglia. La colla si indurirà molto rapidamente e impedirà al capo della larva di muoversi.

Utilizzando pinzette, afferrare con cura l'animale per le scintille posteriori e allungarlo delicatamente. Fissare le larve in questa posizione applicando la colla lungo entrambi i lati delle larve nella metà posteriore. Per ridurre ulteriori movimenti della cuticola da parte dei muscoli della parete corporea, aggiungere altra colla sui fianchi dell'animale.

La larva è ora fissata in questa posizione. Il vetrino coprioggetto può essere posizionato in una piccola capsula di Petri riempita con emolinfa artificiale o PBS; a questo punto i battiti cardiaci possono essere registrati senza interferenze derivanti dai movimenti della parete corporea. Il cuore di *Drosophila* semi-intatto continuerà a battere in modo ritmico per ore dopo la dissezione, se mantenuto in emolinfa artificiale fresca e ossigenata.

Un esempio rappresentativo è mostrato qui e nel filmato supplementare uno: cuori di larve di terzo stadio in stella mostrati qui, e moscerini giovani, da una a tre settimane dopo l'ecdisi, mostrano generalmente un battito cardiaco regolare con frequenze comprese tra uno e tre hertz. I moscerini più anziani di tre settimane sono generalmente più aritmici. Tuttavia, questi cuori sono ancora in grado di contrarsi spontaneamente per ore in emolinfa artificiale ossigenata. Cuori e moscerini adulti danneggiati a seguito della procedura di dissezione mostrano tipicamente regioni localizzate di costrizione estrema che non riescono a rilassarsi e spesso si contraggono in modo incontrollabile. Frequenze cardiache inferiori a un hertz sono raramente osservate in moscerini più giovani di tre settimane di età.

Di conseguenza, tali preparati sono considerati danneggiati e vengono scartati. Abbiamo appena dimostrato come preparare cuori di moscerini adulti per l'analisi mediante imaging ottico. Ricordare che, durante la preparazione semi-integra, non bisogna mai toccare direttamente il cuore.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.