Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

La Drosophila rappresenta un modello geneticamente vantaggioso per lo studio dello sviluppo e della funzione del cuore e dell'attività del marcatore cardiaco sottostante. Questa procedura illustra come preparare larve sia integre che dissezionate e come monitorare la frequenza cardiaca. La preparazione dissezionata consente inoltre di effettuare registrazioni di potenziali extracellulari o intracellulari, permettendo ulteriori approfondimenti sulla funzione dei canali ionici.

Ciao, sono Robin Cooper, membro del corpo docente del Dipartimento di Biologia dell'Università del Kentucky. Oggi i miei studenti, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward ed Easter Boku, vi mostreranno diverse procedure per monitorare la frequenza cardiaca nei larve di Drosophila. Il seguente metodo non vincolante è chiamato "formicaio" perché le larve vengono visualizzate all'interno di un singolo piano focale.

Per una visualizzazione ottimale delle larve, utilizzare un microscopio stereoscopico con un obiettivo principale 2x e un obiettivo tubo 0,5x per ottenere la migliore risoluzione spaziale e ingrandimento su un rettangolo di un centimetro per 0,5 centimetri. Fotografie e video possono essere registrati mediante una telecamera montata sull'oculare. Per iniziare questo metodo, posizionare una larva tra due vetrini, inserendola in un sandwich con uno strato sottile di cibo.

I vetrini sono mantenuti a una distanza di uno a 1,5 millimetri mediante distanziali di plastica su tutti e quattro i lati. Inclinare il preparato tra 20 e 45 gradi per alcuni minuti per favorire il mantenimento della testa della larva rivolta verso il basso. Regolare lo specchio del microscopio per ottenere il migliore contrasto del cuore o delle due trachee, in modo da osservare i battiti cardiaci.

Il metodo della colla è un montaggio permanente per immobilizzare le larve su un vetrino. Per iniziare il metodo della colla, posizionare un coprioggetto pulito sopra un vetrino. Mettere una piccola goccia di colla cianoacrilica su un angolo del coprioggetto.

Successivamente, risciacquare le larve con acqua. Per rimuovere l'eccesso di cibo, assorbire il liquido con un fazzoletto di carta o con l'angolo di un tovagliolo di carta. Una volta che la larva è stata accuratamente risciacquata, prelevarla delicatamente con pinzette pulite e posizionarla sul vetrino lontano dal coprioggetto sotto il microscopio, orientando la larva in posizione prona.

Lo stomaco presenterà deboli solchi orizzontali che si estendono lungo di esso, con peli neri fini. La parte dorsale delle larve deve essere rivolta verso l'alto e presenta due strisce parallele, che sono le trachee. Utilizzando un secondo paio di pinzette dedicato esclusivamente alla manipolazione della colla, prelevare una piccola quantità dalla goccia all'estremità del vetrino e posizionarla nell'angolo sul lato opposto.

Utilizzare una piccola quantità appena sufficiente per coprire la punta della pinzetta. Prendere l'animale e posizionarlo sulla colla assicurandosi che rimanga fermo, con il lato ventrale rivolto verso il basso e la bocca nera.

I ganci devono trovarsi sul bordo o nelle immediate vicinanze del vetrino coprioggetto, allineati con i ganci boccali e la spirale marrone. Non devono toccare la colla. Premere delicatamente sui larvi per appiattirli.

Per applicare una sostanza di prova, è preferibile dispensare piccole gocce con una siringa vicino alla testa della larva. Osservare la frequenza cardiaca contando il numero di volte in cui le spirali pulsano in un minuto. Per osservazioni più lunghe, le larve possono essere alimentate in situ e mantenute umide per prevenire la disidratazione. Per preparare una piastra da dissezione utilizzabile al microscopio, usare un bisturi per tagliare un foro di due centimetri di diametro al centro di un pezzo di nastro magnetico e attaccarlo su un vetrino.

Utilizzare spilli da dissezione piegati e incollati a fermagli di carta per facilitare il fissaggio. Durante la dissezione, posizionare una larva di stella marina integra sul piatto di dissezione, con il lato dorsale rivolto verso l'alto in modo che la trachea sia visibile attraverso la cuticola.

Inserire due puntine nelle larve su entrambi i lati degli uncini boccali e altre due puntine su entrambi i lati delle spirali. Successivamente, aggiungere soluzione salina per mantenere le larve umide. Quindi effettuare un'incisione orizzontale all'estremità addominale, seguita da un taglio longitudinale che deve proseguire lungo il fianco delle spirali in direzione della testa dell'animale.

Sollevare un perno dorsale e agganciarlo sotto il cuticolo. Utilizzare il perno per allargare. Aprire la cavità corporea.

Ripetere con gli altri tre spilli. Una volta che l'animale è stato fissato aperto, rimuovere le viscere avendo cura di non danneggiare la trachea o il cuore. Alcune strutture, tra cui il cervello e alcuni corpi adiposi, sono attaccate al cuore e potrebbero danneggiarlo durante la rimozione.

Lasciare riposare il preparato in un bagno salino HL3 per tre-cinque minuti dopo la dissezione; in questo preparato vengono effettuate registrazioni intracellulari e di campo mentre vengono applicati direttamente al cuore agenti farmacologici. Il tempo totale per questo passaggio di dissezione è di tre-sei minuti. Per effettuare il pacing elettrico, è necessario innanzitutto preparare elettrodi focali: passare un elettrodo di vetro su un elemento riscaldante per lucidarlo a fiamma e creare una curvatura graduale di circa 45 gradi; quindi montare un elettrodo focale riempito con soluzione salina HL3 a temperatura ambiente nel manipolatore con la punta rivolta verso il basso.

Assicurarsi che il filo dello stimolatore sia a contatto con la soluzione salina all'interno dell'elettrodo e che lo stimolatore sia spento. Fissare un nuovo preparato di dissezione cardiaca sul microscopio. Immergere il filo di messa a terra nella soluzione salina.

Avendo cura di non toccare i pinze né disturbare il preparato. Mantenere la concentrazione sull'elettrodo mentre si utilizza il manipolatore per abbassarlo nella soluzione salina. Una volta nella soluzione salina, posizionare la punta dell'elettrodo con il lume appiattito contro il cuore e in leggero contatto con esso.

Una volta posizionato l'elettrodo, impostare la frequenza dello stimolatore a due hertz con la tensione al valore minimo. Accendere lo stimolatore. Regolare la frequenza a circa tre hertz e aumentare lentamente la tensione finché il battito cardiaco non accelera, adeguandosi al ritmo dello stimolatore.

Ora il ritmo può essere manipolato tramite lo stimolatore. È possibile aggiungere composti per verificare se influenzano la contrazione o la conduzione elettrica. Per effettuare registrazioni del potenziale di campo, riempire un elettrodo di registrazione macro patch con il mezzo di bagnatura e montarlo su un manipolatore posto su un microscopio composto.

Collegare l'elettrodo a un amplificatore e a un sistema di registrazione. Utilizzare il manipolatore per abbassare il lume dell'elettrodo sopra il cuore di un preparato di dissezione fissato al microscopio. Toccare molto delicatamente il cuore con la punta dell'elettrodo.

È ora possibile effettuare registrazioni in campo per registrare i potenziali di campo da un'altra regione del cuore. Sollevare delicatamente la punta dell'elettrodo e spostarla in una nuova area utilizzando il manipolatore, quindi abbassare nuovamente la punta per riprendere le registrazioni dei potenziali di campo. Ciò consente un monitoraggio preciso della frequenza e della durata dei segnali elettrici nel cuore al fine di misurare i potenziali transmembrana dei miociti larvali.

Per prima cosa, assicurarsi che la luce di un elettrodo affilato riempito con cloruro di potassio 3 M sia appoggiata al cuore con un angolo di circa 45 gradi rispetto alla verticale. Una volta posizionato correttamente, toccare delicatamente il cuore con la punta dell'elettrodo e picchiettare la punta all'interno di una cellula. L'elettrodo può essere riutilizzato se non è rotto.

Le registrazioni intracellulari permettono di misurare la base ionica del potenziale d'azione e le forme caratteristiche dei potenziali, al fine di esaminare gli effetti di mutazioni nei canali ionici o di modulatori dei canali. Abbiamo appena mostrato come effettuare registrazioni cardiache, nonché come registrare potenziali intracellulari e potenziali di campo. È possibile utilizzare queste tecniche per analizzare alterazioni cardiache, manipolazioni farmacologiche e alterazioni genetiche.

Quando si esegue questa procedura, è importante non tirare su una struttura adiacente collegata al cuore e non premere troppo con l'elettrodo focale. Anche con il metodo della colla, fare attenzione a non incollare la bocca o la sfera chiuse. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i loro esperimenti.