Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila

Al fine di eseguire le ricostruzioni di organi in via di sviluppo all'interno di Drosophila melanogaster, è necessario determinare il modello diretto che descrive nel modo più accurato la propagazione della luce all'interno della pupe stessa. La procedura inizia con la selezione di una pupe bianca pre-pupa, che viene incollata all'estremità di un tubo capillare in modo che l'asse antero-posteriore della pupe sia orientato parallelamente al tubo. Un piccolo tubo capillare viene riempito con un colorante fluorescente e inserito all'interno del caso pupale.

Dopo un accurato aggiustamento degli assi, la pupa viene ruotata di 360 gradi. Le immagini vengono acquisite a diversi angoli. I dati ottenuti mediante illuminazione trans fluorescente vengono utilizzati per determinare il modello diretto che sarà impiegato per l'analisi dello sviluppo degli organi.

Ciao, mi chiamo Claudia e sono del Centro di Biologia Assistenziale del Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Sono Ula Petou del Laboratorio Paramount di Harvard Medical School, e sono Daniel Rozanski dell'Istituto di Imaging Biologico e Medico dell'Università Tecnica di Monaco e del Centro Heliman di Monaco. Oggi vi mostreremo un procedimento per la ricostruzione tridimensionale dell'intero organismo in Oph Melano Casta.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per la visualizzazione in vivo dello sviluppo degli organi durante lo stato della pupilla. Cominciamo dunque. Prima di iniziare, si noti che esiste un video accompagnatorio che dovrebbe essere visto precedentemente a questo, nel quale alcuni aspetti tecnici della tomografia a proiezione ottica sono spiegati in modo più dettagliato rispetto a quanto fatto qui.

Inoltre, l'altro video illustra l'acquisizione di immagini da tessuti o organi preparati di animali più grandi. Per tutti gli esperimenti trattati in questo video, verranno utilizzati transgeni di drosophila. Si tratta di EL A gal four espresso nelle ghiandole salivari, apteris gal four, che è espresso nei tessuti precursori larvali dell'ala e del torace adulto, e il transgene che produce la proteina fluorescente.

In risposta a Gal4 chiamato U-A-S-G-F-P e white 1118, i maschi di controllo non fluorescenti portatori dei transgeni UAS vengono incrociati con femmine vergini portatrici dei transgeni GAL4 per ottenere un'espressione specifica per tessuto. Gli incroci per l'espressione di GFP vengono allestiti utilizzando da otto a dieci femmine vergini e maschi su comune mezzo per Drosophila, con una spolverata di lievito di birra. I flaconi vengono quindi mantenuti in superficie a 25 gradi Celsius in un incubatore umidificato con un ciclo luce/buio di 12 ore.

Due giorni dopo l'inizio dell'incrocio, i genitori vengono trasferiti in un nuovo flacone e, cinque o sei giorni dopo, le PUI inizieranno a popolare il flacone con PrepU. Gli individui PrepUI vengono selezionati per l'espressione di GFP mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza. La selezione di PrepUI bianche garantisce un corretto stadio di sviluppo degli animali, poiché rimangono bianche per circa un'ora.

Dopo la pupazione, diventano pigmentati o di colore brunastro. I pupe che esprimono GFP vengono raccolti delicatamente dai vial utilizzando un pennello umido e posizionati in una goccia d'acqua o PBS in una piastra di Petri, ma devono essere puliti accuratamente da materiali autofluorescenti. Utilizzando il pennello, ora dovrebbero essere pronti per l'immagine tomografica.

Se le PrepU devono continuare l'invecchiamento per raggiungere lo stadio di sviluppo corretto, possono essere lasciate in una piastra di Petri con un tovagliolo di carta bagnato o in un vial pulito per alimenti. Questo garantirà un'umidità sufficiente e uno sviluppo adeguato per l'acquisizione delle immagini. Le PrepU devono essere aderenti all'interno di un tubo capillare di vetro con diametro di 800 micron.

Applicare colla istantanea all'estremità posteriore della pupa; orientare la superficie incollata della pre-pupa all'interno del tubo in modo che l'asse anteriore-posteriore della mosca sia parallelo al tubo. La parte anteriore dell'animale sporgerà oltre il tubo capillare. Il tubo capillare è ora fissato sulla piattaforma rotante del microscopio.

In posizione verticale, regolare l'asse di inclinazione dello stadio rotazionale in modo che l'asse di rotazione del tubo sia parallelo alle colonne di pixel del CCD di acquisizione immagini. Una volta ottimizzata la posizione della mosca, procedere con l'acquisizione delle immagini. In questo esempio, verranno acquisite immagini di animali con ghiandole salivari fluorescenti, in modo che individui esprimenti GFP nelle ghiandole salivari possano essere ottenuti dall'incrocio tra ceppi EAG four e U-A-S-G-F-P.

Iniziamo con una prepupa montata, illuminando la prepupa con un fascio di eccitazione e raccogliendo il segnale fluorescente di GFP. In trasluminazione, ruotare il PrepU di 360 gradi lungo il suo asse verticale e acquisire le immagini di trasluminazione. Ogni immagine corrisponde a 10 gradi di rotazione.

Il tempo totale di acquisizione dipende dalla quantità di fluorescenza e dall'intensità del fascio di eccitazione. I tempi tipici sono dell'ordine di un minuto. In questo esempio, verrà immaginata una pupa di DSO che esprime GFP nei dischi immaginali delle ali.

Questa pupa può essere raccolta da una provetta contenente un incrocio tra ceppi Aus GAL quattro e U-A-S-G-F-P. La pre-pupa viene montata come descritto in precedenza. Tuttavia, poiché il tempo di acquisizione per questo esperimento è di circa otto ore, è fondamentale che l'ambiente rimanga umido e a temperatura ambiente per evitare la disidratazione e la morte dell'animale. Un otturatore viene posizionato sopra il fascio di eccitazione per impedire lo spegnimento dei fiorali quattro nel tessuto di interesse, nonché per assicurare che l'animale non venga bruciato dal fascio laser; come in precedenza, si illumina con il fascio di eccitazione e si raccoglie il segnale fluorescente di GFP mediante illuminazione in trasmissione.

La pre-immaginetta ruota completamente attorno al proprio asse verticale. Durante l'acquisizione dei dati, la rotazione richiede solo un minuto ed è ripetuta a diversi intervalli di tempo. Per creare una serie di immagini in time-lapse dello sviluppo delle ali, i dati possono essere acquisiti per almeno sei ore a una frequenza di 100 immagini all'ora.

È fondamentale che l'esposizione totale alla luce sia controllata mediante questo otturatore, al fine di prevenire danni o foto-sbiancamento. Questo filmato mostra immagini acquisite tra la fase PrepU e l'avversione della testa rispetto alla pupilla. Durante la ricostruzione dell'immagine tridimensionale, si verifica una forte diffusione in avanti che deve essere considerata, e che non può essere approssimata mediante diffusione.

Pertanto, per effettuare la ricostruzione, deve essere determinato un modello di scattering in avanti della propagazione della luce. Per semplicità, trascuriamo l'assorbimento. La quantità di scattering viene verificata sperimentalmente. A tal fine, un oggetto estraneo con fluorescenza standardizzata viene inserito nella prepupa bianca non fluorescente 1118, che viene quindi scansionata per generare i dati del modello in avanti. Iniziare riempiendo un capillare di silice da 100 micron con il colorante fluorescente PS 5.5.

Utilizzando l'azione capillare, inserire il tubo capillare nella pupa con un angolo di 45 gradi rispetto all'asse anteriore, montare il PrepU all'interno del tubo capillare e posizionarlo correttamente sullo stadio rotante come descritto in precedenza. Illuminare ora la prepupa con un fascio laser di eccitazione mediante un obiettivo con bassa apertura numerica e acquisire immagini fluorescenti in trasmissione della prepupa. Come descritto in precedenza, il software MATLAB viene utilizzato per adattare i dati al modello teorico esplicito diretto. Per semplificare il processo di ricostruzione, si sceglie l'approssimazione diffusiva dell'equazione del trasporto, poiché descrive il regime di scattering in avanti e si adatta anche ai dati sperimentali.

Dopo aver determinato il modello diretto corretto, possiamo ricostruire le ghiandole salivari ed ottenere le ricostruzioni tomografiche in time-lapse. Se si prevede di utilizzare una tomografia in spazio libero, è possibile configurare anche gli algoritmi per l'abbinamento dell'indice di rifrazione. Innanzitutto, mostriamo una ricostruzione tridimensionale delle ghiandole salivari in una fase precoce dello sviluppo.

Per confronto, la colorazione istologica delle ghiandole salivari mostra che le ricostruzioni si correlano bene con l'istologia. Questo filmato con microscopia a intervalli dello sviluppo dei dischi immaginali dell'ala è stato ottenuto da un singolo esemplare vivo. Per confronto, la colorazione istologica del disco alare negli stessi punti temporali mostra che le ricostruzioni si correlano bene con l'istologia.

Vi abbiamo appena mostrato come costruire un sistema per acquisire immagini di strutture tridimensionali all'interno di oph in vivo e nel tempo. Ciò ci consente di seguire la morfogenesi in Drosophila e lo sviluppo delle ali per sei ore consecutive. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale scegliere il modello diretto corretto per la propagazione della luce all'interno di Drosophila.

Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con tecniche istologiche per approfondire lo sviluppo degli organi durante le fasi larvali di oph, ed è modificabile per lo studio di diversi organismi di dimensioni simili. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.