Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

La proteomica clinica è una nuova disciplina importante che promette la scoperta di biomarcatori utili per la diagnosi precoce e la prognosi delle malattie. In questo studio riportiamo un nuovo metodo di microfluidica digitale, o DMF, che integra diverse fasi di lavorazione utilizzate nella proteomica clinica, tra cui l'estrazione delle proteine, la risolubilizzazione, la riduzione, l'alkilazione e la digestione enzimatica. La microfluidica digitale utilizza goccioline discrete di proteine del campione su un array di elettrodi ed è eseguibile a temperatura ambiente, consentendo l'analisi parallela e automatizzata dei campioni.

Questa metodologia rappresenta un notevole progresso rispetto ai metodi convenzionali e potrebbe costituire un nuovo strumento utile nella proteomica clinica. Ciao, sono Steve Sche del laboratorio della Professoressa Erin Wheeler del Dipartimento di Chimica e dell'Istituto di Biomateriali e Ingegneria Biomedica dell'Università di Toronto. Ciao, sono Gabriel del laboratorio Wheeler dell'Università di Toronto.

E io sono Vivian Luke, anch'io del laboratorio Wearer dell'Università di Toronto. Io sono Erin Wheeler. Ho la fortuna di lavorare con Steve Mace e Vivian.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'elaborazione proteomica mediante microfluidica digitale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per lo studio di proteine e campioni biologici. Cominciamo dunque.

Iniziare la procedura nella cappa aspirante pulendo i substrati di vetro con la soluzione di Piranha. Indossando un'adeguata protezione, la soluzione di Piranha è composta da tre parti di acido solforico concentrato e una parte di perossido di idrogeno al 30%. Pertanto, è necessario prestare molta attenzione durante il suo utilizzo.

Incubare i substrati di vetro nella soluzione piranha per 10 minuti; dopo la pulizia, risciacquarli con acqua deionizzata o desalinizzata e asciugare i substrati con gas azoto. Posizionare i substrati all'interno della camera di evaporazione a fascio di elettroni per la deposizione di cromo fino a uno spessore di 250 nanometri. Rimuovere i substrati dalla camera una volta raggiunto tale spessore e risciacquare con isopropanolo, quindi asciugare su una piastra riscaldante per cinque minuti a 115 gradi Celsius.

Primingere i substrati essiccati con esametilxilazina o HMDS mediante rivestimento a centrifuga per 30 secondi. Eseguire nuovamente la centrifugazione a 3000 giri al minuto con il fotoresist Shipley S 1811 utilizzando parametri identici.

Preriscaldare il substrato direttamente su una piastra riscaldante a 100 gradi Celsius per minuti. Successivamente, definire il photoresist esponendolo a irradiazione ultravioletta o UV attraverso una maschera fotolitografica per cinque secondi. Poi, sviluppare i substrati esposti all'UV nel developer Shipley MF 3 21, in quantità sufficiente a immergere il substrato, per tre minuti dopo tale esposizione.

Risciacquare il substrato in acqua deionizzata dopo. Cuocere direttamente su una piastra riscaldante a 100 gradi Celsius per un minuto. Incidere il cromo esposto immergendo i substrati per 30 secondi in una quantità sufficiente di soluzione incisoria per cromo da coprirli completamente.

Risciacquare i substrati con acqua deionizzata e immergerli in uno striper Z 300 T in quantità sufficiente a coprire completamente il substrato per 10 minuti, per rimuovere il photoresist residuo. Risciacquare nuovamente con acqua deionizzata ed essiccare con gas azoto.

Dopo questo deposito, da due a cinque micrometri di Paraline C., un polimero isolante, vengono depositati sul substrato mediante deposizione chimica da vapore; successivamente, vengono depositati 50 nanometri di Teflon AF per rendere la superficie idrofoba, rivestendo mediante spin coating una soluzione al 1% in peso in Fluorinert FC-40 a 2000 giri al minuto per 60 secondi sul substrato.

Ripetere con un substrato di ossido di indio e stagno non passivato o vetro ITO per creare il piatto superiore. Cuocere entrambi i substrati su una piastra riscaldante a 160 gradi Celsius per 10 minuti per assemblare il dispositivo microfluidico digitale.

Rimuovere i rivestimenti polimerici dalle piazzole di contatto di un substrato inferiore grattando con un bisturi. Collegare le piazzole esposte del substrato inferiore a connettori a 40 pin alimentati su un computer che esegue LabVIEW. Utilizziamo un box di controllo autocostruito che contiene relè con segnali controllati da un dpad.

Il contenitore di controllo del computer consente all'utente di gestire l'applicazione di 100 volt RMS per segnali di 18 kilohertz al dispositivo tramite i connettori a 40 pin. Accendere anche un generatore di funzioni e un amplificatore. Assemblare il dispositivo posizionando due pezzi di nastro adesivo doppia faccia dello spessore totale di 140 micrometri sui bordi del substrato inferiore.

Pipettare quattro microlitri di acqua deionizzata in uno dei serbatoi e chiudere il dispositivo posizionando la lamella di ossido di indio e stagno non stampata sulla parte superiore del dispositivo, con il lato rivestito in teflon rivolto verso il basso. Collegare un connettore di massa alla piastra superiore. Il programma di inizializzazione sviluppato in laboratorio in LabVIEW consente di calibrare il controllo in retroazione; il dispositivo è ora pronto per gli esperimenti.

In questo protocollo, utilizzeremo l'albumina sierica bovina o BSA come campione proteico per dimostrare la progettazione e l'uso della nostra microfluidica digitale. La BSA viene diluita nel buffer di lavoro o WB, costituito da tris HCl 100 millimolare pH 7,8 con 0,08% in peso/volume di F127. Preparare un millilitro di ciascuna soluzione campione e reagente e indicare il serbatoio in cui verrà aggiunta.

Dopo aver preparato i reagenti, rimuovere la piastra superiore dal dispositivo e pipettare quattro microlitri di soluzione nel relativo serbatoio. Dopo aver riempito i serbatoi, riposizionare la piastra superiore sul dispositivo. Utilizzare il programma interno di visualizzazione del laboratorio per eseguire i seguenti passaggi.

Ricordare che l'interfaccia computerizzata consente all'utente di erogare gocce di circa 600 nanolitri dai serbatoi e di manipolare le gocce sulla matrice di elettrodi. In primo luogo, erogare una goccia di campione contenente proteina dal serbatoio uno e una goccia di precipitante dal serbatoio due. Unire le due gocce e lasciare che la goccia combinata incubi per cinque minuti, in modo che le proteine precipitino sulla superficie.

Aspirare il soprannatante lontano dal precipitato proteico e convogliarlo nel serbatoio di scarto. Per lavare il precipitato proteico, erogare tre gocce di buffer di lavaggio da R quattro e spingerle attraverso il precipitato proteico fino al serbatoio di scarto. Lasciare asciugare il precipitato ed erogare una goccia di buffer di risolubilizzazione da R cinque direttamente sulla proteina.

Lasciare incubare il tampone per 20 minuti fino a quando il precipitato si sarà sciolto. Successivamente, dispensare una goccia di agente riducente da R sei e unirla alla goccia del campione. Mescolare la goccia combinata attivandola attraverso sei elettrodi secondo un percorso circolare.

Lasciare incubare la goccia per un'ora a temperatura ambiente. Dispensare una goccia di agente alchilante da R sette e unirla alla goccia del campione, quindi mescolare. Lasciare incubare la goccia per 15 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce.

Infine, dispensare una goccia di tripsina dal pozzetto R8 e unirla alla goccia del campione, quindi mescolare. Lasciare incubare la goccia per tre ore a 37 gradi Celsius in una piastra di Petri su un piastrino riscaldato. Per terminare la reazione, rimuovere la piastra superiore e arrestare la digestione mediante pipettaggio.

Aggiungere 0,6 mL di acido tricloroacetico al 2,5% in acqua sulla goccia di reazione. Purificare il prodotto di reazione spento aspirando direttamente la goccia di campione dalla piastra inferiore. Utilizzando una C 18 zip tip, secondo le istruzioni del produttore, i campioni possono ora essere diluiti secondo necessità e analizzati mediante spettrometria di massa per identificare le proteine nel campione utilizzando questo sistema.

Successivamente, le proteine sono state identificate mediante spettrometria di massa con punteggi di probabilità inferiori a uno per E alla meno tre, equivalenti a un intervallo di confidenza del 99,9% e coperture di sequenza di almeno il 30%. Pertanto, la DMF rappresenta una metodologia molto utile per l'elaborazione automatizzata di campioni proteomici. Oggi abbiamo semplicemente mostrato come utilizziamo la microfluidica digitale per estrarre ed elaborare le proteine in modo automatizzato. Questa metodologia fornisce una potenziale soluzione per la perdita di campione e la contaminazione durante l'isolamento e l'identificazione delle proteine.

Speriamo di applicare questo metodo in futuro ad altre applicazioni biologiche, inclusi saggi immunologici e saggi basati su cellule. Quando si esegue questo tipo di esperimento, la cosa più importante è ricordarsi di goderselo. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.