High-throughput generatore di espressione delle proteine Utilizzando una piattaforma microfluidica
23 agosto 2012
Presentiamo un approccio microfluidica per l'espressione di proteine array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all'uso sperimentale.
L'obiettivo generale di questa procedura è creare un array proteico modulare che non richieda un passaggio di purificazione, rendendolo compatibile con qualsiasi libreria proteica. Questo viene ottenuto innanzitutto generando geni sintetici mediante PCR di assemblaggio. Successivamente, i geni sintetici vengono disposti su vetrini epossidici.
Per realizzare il dispositivo microfluidico, utilizzare PDMS con stampi in silicone per il controllo e il flusso. Successivamente, il dispositivo microfluidico viene allineato all'array di DNA stampato. Infine, il lisato di reticolociti di coniglio viene fatto fluire all'interno del dispositivo microfluidico e le proteine vengono espresse.
Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'espressione di migliaia di proteine mediante etichettatura con anticorpi fluorescenti. Esistono diversi vantaggi nell'utilizzo della tecnica basata su microfluidica rispetto ai metodi esistenti, come i microarray proteici. Noi microarrayiamo il DNA e poi utilizziamo cellis per produrre proteine sul dispositivo.
Pertanto, non è necessaria la purificazione delle proteine e le proteine non si seccano mai. Rimangono fresche per tutta la durata dell'esperimento. La tecnica microfluidica offre inoltre una sensibilità maggiore. Per realizzare il dispositivo microfluidico, esporre gli stampi in silicone per il controllo e il flusso al vapore di clorotrimetilsilano per 10 minuti per favorire il rilascio dell'elastomero.
Dopo i passaggi di cottura, preparare una miscela di elastomero a base di silicone e agente indurente in due rapporti diversi: cinque a uno e venti a uno, rispettivamente per i modelli di controllo e di flusso. Versare il PDMS in rapporto cinque a uno sullo strato di controllo. Sottoporre lo strato di controllo a degasaggio e cuocerlo per 30 minuti a 80 gradi Celsius.
Successivamente, applicare per spin-coating il miscuglio di PDMS in rapporto 20:1 sullo strato di flusso a 2.600 giri al minuto per 60 secondi, quindi polimerizzare a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Separare lentamente lo strato di controllo dallo stampo, avendo cura di non staccare il pattern di SU-8. Quindi, utilizzando un bisturi, ritagliare il dispositivo lungo il suo perimetro e praticare dei fori con un ago smussato per accedere ai canali di controllo, sotto un microscopio.
Allineare manualmente i livelli di flusso e di controllo a partire dall'angolo in alto a sinistra, posizionando la valvola a pulsante sul livello di controllo al centro della camera di reazione. Successivamente, allineare la prima riga e rilasciare delicatamente il livello di controllo riga per riga. Assicurarsi che tutte le valvole a pulsante siano posizionate al centro delle camere di reazione e che le valvole di indirizzo e di ingresso attraversino i canali di flusso nella posizione corretta.
Ripetere il processo localmente fino a quando tutte le righe non sono allineate. Una volta completamente allineate, rilasciare qualsiasi tensione nel PDMS sollevandolo con cura dai lati e dagli angoli. Quindi cuocere il dispositivo per due ore a 80 gradi Celsius dopo la cottura.
Tagliare lungo il perimetro e staccare il dispositivo a due strati dai fori dello stampo di flusso per accedere ai canali di flusso al fine di generare costrutti di DNA per il dispositivo. Eseguire la PCR per produrre geni sintetici composti da un promotore T7, un sito di legame per il ribosoma, una sequenza codificante con diversi marcatori epitopici a ciascuna estremità e un terminatore T7. Per preparare i geni sintetici per il posizionamento in array, preparare una miscela di polietilene glicole e diidrato di D-triosio ed erogare due microlitri per reazione nei pozzetti di un piatto da 384.
Piastra a pozzetti. Aggiungere i geni sintetici in una piastra a 384 pozzetti. Quindi aggiungere acqua distillata fino a un volume finale di 20 microlitri.
Successivamente, utilizzando un puntino di microarray, depositare una serie di geni sintetici su substrati di vetro rivestiti di epossido. Sotto uno stereomicroscopio, allineare manualmente il dispositivo microfluidico all'array genico posizionando il puntino di DNA al centro delle camere per il DNA. Quindi allineare le restanti file.
Completare con un'ottimizzazione fine dell'intero dispositivo per alleviare qualsiasi sollecitazione sul PDMS e assicurare un'adeguata adesione alla matrice microscopica. Sollevarlo localmente. Infine, far aderire il dispositivo al vetrino incubandolo tutta la notte su una piastra riscaldante a 80 gradi Celsius.
I coloranti alimentari vengono utilizzati in questa sezione a scopo di visualizzazione. Le valvole nello strato di controllo vengono attivate dal computer mediante LabVIEW. Lo script di LabVIEW controlla una serie di valvole microsolenoide attraverso un'apposita scatola elettronica di controllo.
Il collettore di valvole solenoidi è collegato all'aria compressa, che controlla il flusso d'aria e la pressione nelle valvole di controllo del dispositivo. Utilizzando un tubo flessibile in plastica con diametro interno di 0,02 pollici e un perno in acciaio inossidabile, collegare il dispositivo al collettore di valvole solenoidi. Riempire i tubi con acqua bidistillata ed inserire il perno nei fori di accesso dello strato di controllo.
Assicurarsi che ogni tubo sia collegato al proprio canale di controllo corrispondente. Per attivare i canali di controllo, eseguire l'applicazione LabVIEW, impostare la pressione dell'aria a cinque PS.I, quindi applicare la pressione dell'aria attivando la valvola tramite lo script LabVIEW. Questo spingerà l'acqua nei canali di controllo in PDMS per identificare eventuali interferenze tra i canali di controllo dei dispositivi difettosi.
Riempire prima le valvole del sandwich e quelle dell'indirizzo. Dato che i canali di controllo e le valvole sono pieni di acqua, eseguire la messa a punto delle valvole per bloccare i canali di flusso sottostanti. Aumentare innanzitutto la pressione dell'aria a 15 PSI, quindi nel programma di visualizzazione del laboratorio, tramite un insieme di interruttori on/off collegati a valvole solenoidi individuali.
Attivare tutte le valvole accendendo tutti i pulsanti di commutazione per assicurarsi che tutte le valvole siano aperte. Collegare un tubo a uno degli ingressi di flusso ed immettere aria nel dispositivo a una pressione di quattro-cinque PSI. Questo permetterà di sbloccare eventuali valvole bloccate sulla lamella di vetro.
Il dispositivo è ora condizionato e pronto per le finalità di visualizzazione. Viene utilizzato un colorante alimentare giallo per visualizzare i reagenti in questa sezione e la soluzione incolore rappresenta gli hippies per facilitare l'autoassemblaggio di un array proteico sulla superficie e prevenire l'assorbimento non specifico all'interno del dispositivo microfluidico; modificare chimicamente la superficie collegando innanzitutto un nuovo tubo contenente la soluzione richiesta a uno dei canali di flusso del dispositivo. Successivamente, collegare l'estremità libera del tubo al manifold manuale e aprire il flusso di pressione d'aria.
Caricare 40 microlitri di BSA marcati con biotina in un nuovo tubo ed eluire circa la metà attraverso il dispositivo per 20 minuti. Utilizzare 50 millimoli di hippies per lavare via ogni substrato non reagito tra ciascun passaggio. Successivamente, far passare 25 microlitri di streptavidina per 20 minuti.
Sopra l'BSA biotinilata, lavare con HES per cinque minuti per saturare la superficie circostante il pulsante, chiudere la valvola del pulsante e far passare il resto dell'BSA biotinilata, quindi lavare nuovamente con HEPES per cinque minuti. Infine, per creare un array di tag anti-His sotto il pulsante, aprire la valvola del pulsante e far fluire 30 microlitri di Penta-His biotinilato per 20 minuti, in modo da generare un array di proteine sul dispositivo. Aprire le valvole del collo e far fluire il reticolocito di coniglio.
Soluzione rapida di reazione accoppiata di trascrizione e traduzione attraverso il dispositivo nella camera del DNA. Successivamente, chiudere le valvole a sandwich per separare ogni gene dal suo ambiente e incubare il dispositivo su una piastra riscaldante per 2,5 ore a 30 gradi Celsius. Quindi etichettare il termine finale delle proteine con l'anticorpo C mix SI tre.
Infine, utilizzando uno scanner per microarray con un laser a 532 nanometri e un filtro di emissione a 575 nanometri, determinare i livelli proteici. Questa figura mostra i diversi livelli di espressione proteica su un array proteico.
Di solito, il 20% di una libreria genica non esprime livelli rilevabili. I livelli di fondo sono stati determinati utilizzando camere che non erano state spotted con DNA. Pertanto, i segnali provenienti dalle camere proteiche corrispondenti sono dovuti a rumore o all'assorbimento non specifico degli anticorpi marcatori.
Se eseguita correttamente, la verifica del dispositivo richiede quattro ore e l'esperimento con il chip ne richiede cinque.
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Panoramica
Questo studio presenta un approccio microfluidico per l'espressione di matrici proteiche, che utilizza un dispositivo dotato di migliaia di camere di reazione controllate da valvole micro-meccaniche. L'integrazione di una libreria genica stampata su microarray consente la trascrizione e la traduzione direttamente sul chip, producendo una matrice proteica pronta all'uso.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microfluidica
- Espressione proteica
- Librerie geniche
Sfondo
- Le matrici proteiche sono essenziali per vari saggi biologici.
- I metodi tradizionali richiedono spesso passaggi di purificazione, limitando la compatibilità.
- I dispositivi microfluidici possono semplificare il processo di espressione proteica.
- La PCR di assemblaggio viene utilizzata per generare geni sintetici da disporre in matrice.
Scopo dello studio
- Creare un array proteico modulare senza passaggi di purificazione.
- Migliorare la compatibilità con qualsiasi libreria proteica.
- Migliorare l'efficienza dell'espressione proteica utilizzando la microfluidica.
Metodi Utilizzati
- Generazione di geni sintetici mediante PCR di assemblaggio.
- Disposizione di geni sintetici su vetrini epossidici.
- Realizzazione di un dispositivo microfluidico utilizzando PDMS.
- Flusso di lisato di reticolociti di coniglio nel dispositivo per l'espressione proteica.
Risultati principali
- È stato creato con successo un dispositivo microfluidico funzionale.
- Le proteine sono state espresse direttamente sul chip senza purificazione.
- Il metodo ha dimostrato compatibilità con diverse librerie proteiche.
- La trascrizione e la traduzione direttamente sul chip sono state realizzate in modo efficace.
Conclusioni
- Questo approccio microfluidico semplifica la creazione di array proteici.
- Elimina la necessità di purificazione, migliorando l'usabilità.
- La tecnica può essere applicata a diverse librerie proteiche per la ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa piattaforma microfluidica per l'espressione proteica consente la produzione ad alto rendimento di matrici proteiche funzionali senza necessità di purificazione, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella validazione degli target e nel screening delle interazioni. Mantenendo le proteine in uno stato nativo e non denaturato direttamente sul chip, il metodo permette un rilevamento affidabile delle interazioni proteina-proteina, proteina-DNA e proteina-RNA. Questa capacità aumenta la sicurezza predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, riducendo i falsi negativi derivanti dalla perdita o dal malfunzionamento delle proteine durante la purificazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la validazione funzionale del bersaglio esprimendo proteine a lunghezza intera con ripiegamento corretto e modifiche post-traduzionali.
- Valore operativo: Elimina i passaggi di purificazione, riducendo la perdita di campione e aumentando la produttività per lo screening su larga scala di librerie.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio meccanicistica fornendo dati quantitativi di espressione per migliaia di varianti in parallelo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera array proteici standardizzati direttamente da template di DNA, garantendo coerenza tra diversi lotti per saggi di interazione riproducibili.
- Valore operativo: Integra l'allestimento di array genici e l'espressione proteica in un singolo dispositivo microfluidico, riducendo al minimo il tempo di manipolazione manuale e il rischio di contaminazione incrociata.
- Prontezza per il saggio: Produce segnali fluorescenti quantificabili compatibili con scanner per microarray, per la mappatura ad alta densità di interazioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Consente un profilo rapido delle interazioni proteiche su bersagli rilevanti per le malattie identificati in studi omici preliminari.
- Allineamento del Biomarcatore: Permette lo screening di autoanticorpi o eventi di legame terapeutici mediante l'uso di campioni derivati da pazienti su matrici di antigeni espressi.
- De-risking Preclinico: Consente una valutazione precoce del legame fuori bersaglio o dei profili di cross-reattività prima di proseguire con lo sviluppo dei candidati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla preparazione di librerie geniche sintetiche allo screening delle interazioni, consentendo una transizione fluida dall'identificazione del bersaglio alla validazione del capostipite.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi esprimendo geni in forma ordinata per valutare l'attività funzionale delle proteine senza bias derivanti dalla purificazione.
- Screening: Fornisce array proteici standardizzati e freschi, pronti per l'uso immediato in saggi biochimici o biofisici di interazione.
- Analisi: Offre letture quantitative basate sulla fluorescenza che consentono il confronto tra livelli di espressione e affinità di legame in migliaia di condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega le varianti genetiche agli output proteici funzionali, permettendo la correlazione con dati fenotipici o clinici.
- Riutilizzo aziendale: La piattaforma microfluidica può essere riprogrammata con nuovi array di DNA, sostenendo campagne di screening iterative in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi esprimendo le proteine in uno stato nativo, riducendo gli artefatti derivanti dalla purificazione o dalla denaturazione.
- Valore operativo: Consente l'elaborazione parallela di migliaia di reazioni in uno spazio ridotto, migliorando l'efficienza dei reagenti e la produttività.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) generando rapidamente dati sulle interazioni per ampie librerie di varianti.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione degli obiettivi con adeguamento del rischio, basandosi su profili completi di interazione e fedeltà dell'espressione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di dispositivi microfluidici, inclusa la stampatura in PDMS e l'allineamento degli strati.
- Presuppone l'accesso a strumentazione per la deposizione di microarray al fine di generare matrici di DNA e a sistemi di controllo microfluidico (ad esempio, LabVIEW con valvole solenoidi).
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione di librerie geniche, inclusa la PCR di assemblaggio e l'aggiunta di marcatori epitopici per il rilevamento.
- Richiede l'ottimizzazione dei tempi di incubazione e delle concentrazioni dei reagenti (ad esempio, lisato di reticolociti di coniglio, reagenti biotinilati) in funzione di specifici obiettivi di espressione proteica.
- È limitato dalla disponibilità di strutture per la fabbricazione microfluidica e dalle competenze tecniche necessarie per un preciso allineamento e incollaggio degli strati.
