L'adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

Il sistema Bio Flux è uno strumento automatizzato e un dispositivo microfluidico per eseguire saggi su cellule vive in condizioni di flusso controllato. Questo sistema utilizza una tecnologia microfluidica basata su piastre a pozzetti per integrare dispositivi di flusso su scala micrometrica in piastre a pozzetti standard SBS. BioFlex può essere utilizzato per condurre studi sull'adesione e l'aggregazione delle piastrine con elevata produttività e ridotti volumi di sangue.

Del sangue intero marcato con un colorante fluorescente viene aggiunto alle pozzette e quindi fatto fluire attraverso i canali. In condizioni di flusso tagliente controllato, vengono prodotti dati microscopici ad alta risoluzione, che quantificano l'adesione e l'aggregazione delle piastrine in presenza di composti farmacologici e altri parametri variabili. Ciao, sono Mike Schwartz del laboratorio di R&S di Flexion Biosciences.

Oggi vi mostreremo un procedimento per l'utilizzo di celle a flusso microfluidiche in saggi di adesione delle piastrine. Utilizziamo questo protocollo nel nostro laboratorio per una varietà di saggi di biologia vascolare. Cominciamo dunque.

Prima di eseguire l'esperimento con la cella a flusso, i canali microfluidici della piastra Bio Flux devono essere preparati con un rivestimento proteico di interesse; in questo esperimento verrà utilizzato collagene di tipo I. Ciascuno dei 24 canali sperimentali della piastra Bio Flux è collegato a una pozzetta di ingresso e a una pozzetta di uscita. La pozzetta di ingresso è quella a sinistra, che alimenta il canale, mentre la pozzetta di uscita si trova a destra; diluire la soluzione madre di collagene di tipo I fino a una concentrazione di 200 microgrammi per millilitro.

In acido acetico 0,02 molare, saranno necessari 20 microlitri per ogni canale utilizzato. Poiché questo esperimento richiede 11 canali, preparare 200 microlitri di rivestimento di collagene. Un canale rimane non rivestito, mescolato delicatamente con la punta di una micropipetta.

Aggiungere 20 microlitri di rivestimento in ciascun canale corrispondente utilizzando una micropipetta per dispensare il liquido nel punch interno della pozzetta. Alimentare il canale microfluidico di interesse, come mostrato qui con il colorante giallo, includendo un canale senza collagene come controllo negativo per l'adesione e l'aggregazione delle piastrine. Dopo aver aggiunto il rivestimento di collagene a tutti i canali corrispondenti, collegare l'interfaccia alla piastra.

Se si utilizza l'interfaccia bio flux 1000, è possibile bloccare entrambi i fermi sulla piastra. Se si utilizza l'interfaccia Bio flux 200, stringere prima con le dita le quattro viti. Successivamente, una volta posizionate tutte, utilizzare il chiavino dinamometrico per serrare completamente.

Il chiavino dinamometrico emetterà un clic quando raggiunge il massimo. Utilizzando la modalità manuale nel software bio flux, applicare la perfusione ai canali di interesse a 2D per centimetro quadrato a partire dall'uscita. Utilizzeremo un obiettivo a basso ingrandimento su un microscopio per individuare il pozzetto di ingresso e osservare il riempimento del foro interno opposto con liquido.

Dovrebbe innanzitutto osservare una piccola goccia di liquido che lentamente riempie l'ago interno dopo alcuni minuti; quando l'ago interno di ingresso è pieno, arrestare il flusso su tutti i canali premendo stop nel software. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Durante questo periodo di incubazione, è possibile iniziare a preparare il sangue intero alla fine dell'incubazione di un'ora.

Dopo aver preparato il sangue, rimuovere l'interfaccia e aggiungere un millilitro di PBS contenente ioni calcio e magnesio all'uscita. Iniziare la perfusione dal pozzetto di uscita a due dyne per centimetro quadrato e continuare la perfusione per 10 minuti. Dopo 10 minuti, arrestare la perfusione. Dopo aver rimosso l'interfaccia, eliminare il PBS in eccesso sia dai pozzetti di ingresso che di uscita.

Non rimuovere mai il liquido che riempie l'ago interno. Per bloccare i canali, aggiungere un millilitro di soluzione di blocco a ciascun pozzetto di uscita. Il pozzetto da utilizzare deve essere perfuso a partire dal pozzetto di uscita a due dine per centimetro quadrato e continuare la perfusione per 10 minuti.

Interrompere la perfusione dopo 10 minuti e rimuovere l'interfaccia. I canali sono ora pronti e possono essere utilizzati per tutto il giorno mentre la piastra viene rivestita con collagene. Durante un'incubazione di un'ora, deve essere preparato sangue umano fresco proveniente da un soggetto a digiuno per l'analisi mediante imaging e per l'infusione nella piastra.

Il sangue deve essere prelevato in citrato di sodio, anticoagulante, e utilizzato entro tre ore dal prelievo. Per prima cosa, aggiungere un stock di calcio da quattro millimolari in DMSO al sangue in una diluizione di uno a mille in volume su volume. Per ottenere una concentrazione di quattro micromolari di calcio, mescolare mediante inversione delicata.

Successivamente, distribuire un millilitro del sangue etichettato con calcio am in dieci microtubi da uno virgola cinque millilitri. Aggiungere a ogni tubo l'anticorpo inibitore GP2B3A al diluizione desiderata. Assicurarsi di includere un controllo negativo senza anticorpo e un controllo positivo con anticorpo non correlato, mescolando delicatamente mediante inversione.

Incubare i tubi a temperatura ambiente per un'ora, mescolando con inversioni delicate ogni 10 minuti prima di eseguire l'esperimento con la cella a flusso. Nel modulo di controllo Bio Flux deve essere impostato un protocollo automatizzato per il collagene.One. Impostare un protocollo per far scorrere il sangue a dieci nove centimetri quadrati per 10 minuti a partire dall'uscita.

Beh, utilizzando la stazione di lavoro BioFlex 1000, è necessario impostare i parametri di acquisizione dati, che includono l'acquisizione delle posizioni desiderate della piastra alla lunghezza d'onda fitz e l'impostazione per acquisizioni temporizzate. Un piano tipico di acquisizione immagini per questo protocollo prevede un campo visivo per canale da acquisire ogni 30 secondi mediante un obiettivo 10x per una durata totale di 10 minuti. Sono inoltre possibili ulteriori campi visivi e diverse impostazioni di acquisizione temporizzata.

Dopo aver configurato il protocollo automatizzato e i parametri di acquisizione dei dati, tornare alla piastra BioFlex e rimuovere il liquido da entrambi i lati del canale, lasciando solo le punzonature interne. Avendo cura di lavorare rapidamente, aggiungere 500 microlitri di sangue per ogni condizione nei pozzetti di uscita di ciascun canale. Si noti che i pozzetti di uscita vengono utilizzati per somministrare il sangue poiché rappresentano il percorso più breve verso la zona di osservazione e garantiranno una reazione più immediata del sangue al rivestimento di collagene.

Inoltre, posizionare il sangue di controllo senza anticorpo in un canale rivestito con collagene e in uno semplicemente bloccato. Posizionare la piastra sul microscopio della stazione di lavoro BioFlex 1000 e fissare l'interfaccia. Eseguire la calibrazione dell'elenco delle posizioni individuando il primo punto di calibrazione, definito come origine.

Quindi individuare e contrassegnare il secondo punto di calibrazione. Applicare questa calibrazione all'elenco di stage appropriato. Ciò garantisce che tutte le posizioni di osservazione sulla piastra possano essere trovate automaticamente.

Spostare la piastra su uno dei canali contenenti sangue e impostare i parametri di acquisizione delle immagini, come il tempo di esposizione e il guadagno, nel software BioFlex montage. Avviare il flusso di lavoro appropriato cliccando sul pulsante desiderato. Questo avvierà contemporaneamente il protocollo di flusso e l'acquisizione delle immagini.

Al termine dell'esperimento, rimuovere la piastra dalla stazione BIOFLU 1000 e smaltirla secondo le linee guida istituzionali. Utilizzando canali microfluidici rivestiti con collagene del sistema bio flux. Si osserva nel tempo una formazione aggressiva di trombi con il campione di sangue di controllo non trattato.

Al contrario, non si osserva formazione di trombi nel canale non rivestito. In un esperimento recentemente eseguito, la dimensione media degli aggregati in condizioni di controllo era di 2000 micrometri quadrati. GP due B tre A è un mediatore potente delle interazioni tra piastrine e della stabilizzazione dell'aggregazione, quando viene attivato dall'adesione al collagene; come mostrato qui dopo incubazione con anticorpo anti-GP due B tre A per un'ora prima dell'esposizione al flusso di taglio, si osserva una riduzione della dimensione dei trombi così come una diminuzione della frequenza di formazione dei trombi.

Una risposta dipendente dalla dose può generalmente essere osservata a dieci centimetri quadrati e il valore di IC 50 per questo particolare inibitore era di 17 nanomolar. L'inibizione massima per questo donatore, rispetto al controllo senza anticorpo, era dell'11% a 10 centimetri quadrati. È inoltre disponibile una piastra ad alto taglio da 48 pozzetti per eseguire esperimenti con sangue intero fino a 200 D per centimetro quadrato o 5.000 al secondo.

Abbiamo appena mostrato come utilizzare canali di flusso microfluidici per condurre esperimenti di biologia vascolare fisiologicamente rilevanti. Quando si esegue questo protocollo, è importante ricordare di diluire il collagene nel tampone corretto. Utilizzare sempre una tecnica di pipettaggio corretta per evitare l'introduzione di bolle d'aria e seguire sempre le norme di biosicurezza del proprio laboratorio.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.