Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

L'obiettivo generale di questo articolo video è descrivere una tecnica per sottoporre cellule aderenti a condizioni di flusso laminare e valutare la risposta a stress di taglio del fluido ben quantificabili. Questo viene realizzato assemblando innanzitutto il circuito di flusso senza la camera di flusso. Il circuito comprende il serbatoio del polso, l'ammortizzatore di pulsazioni, i tubi rigidi, i tubi flessibili, i rubinetti a quattro vie e gli adattatori a baionetta collegati, nonché un filtro dell'aria.

Il passaggio successivo consiste nel riempire il circuito con il fluido desiderato, ad esempio il mezzo cellulare in condizioni sterili, quindi avviare la pompa per riempire l'ammortizzatore di pulsazione ed espellere l'aria dai tubi. Successivamente si inserisce la lamellina con le cellule nella piastra inferiore della camera di flusso. L'ultimo passaggio della procedura è il montaggio completo del circuito di flusso, con la camera di flusso inserita in linea.

I risultati finali possono dimostrare l'allineamento di cellule progenitrici endoteliali marcate con fluorescenza sotto esposizione a stress da taglio del fluido, osservato attraverso una camera trasparente mediante microscopio a fluorescenza. Per studiare il comportamento funzionale delle cellule, è spesso necessario imitare la fisiologia in vivo sottoponendo le cellule a stress da taglio del fluido. Abbiamo progettato una camera a piastre parallele e un circuito a flusso continuo, che ci permettono di studiare le cellule in condizioni di flusso e di osservarle attraverso la camera trasparente.

Questa tecnica può rappresentare uno strumento di ricerca prezioso per i settori della medicina e dell'ingegneria. La nostra camera di flusso consente la visualizzazione intermittente o in tempo reale di cellule in condizioni di flusso, utilizzando un microscopio diritto o invertito. Inoltre, il design del Dott. Ach Nick permette ai ricercatori di acquisire immagini di cellule su superfici trasparenti o radiopache impiegando obiettivi microscopici standard.

Inoltre, può rappresentare uno strumento importante nella ricerca farmacologica per studiare l'effetto dei farmaci sulle cellule in condizioni di flusso. La visualizzazione dell'allestimento è fondamentale poiché diversi passaggi risultano difficili da apprendere soltanto leggendo un protocollo. Fornirò istruzioni dettagliate su come allestire la camera a flusso e il circuito di flusso comunemente utilizzati nel laboratorio del Dott. Ock Next per assemblare il circuito di flusso.

Iniziare collegando un segmento di tubo rigido lungo 36 pollici a un'estremità di un smorzatore di impulsi e l'altra estremità. Collegare un segmento di tubo flessibile lungo 18 pollici. Posizionare un adattatore filettato maschio da un ottavo di pollice all'estremità del tratto di tubo flessibile da 18 pollici.

Collegare l'esca maschio a un adattatore femmina da un ottavo di pollice. Fissare l'esca femmina a un nuovo segmento di tubo flessibile lungo 18 pollici. Praticare tre fori nel tappo di un becher di vetro da 250 millilitri.

Per adattare il tubo, inserire un segmento di tubo morbido lungo 1,5 pollici in un foro, come sfiato d'aria. Inserire le estremità libere del tubo rigido e di quello morbido attraverso gli altri due fori nel tappo, all'interno del flacone di vetro da 250 millilitri, che fungerà da serbatoio.

Assicurarsi che il tubo rigido raggiunga il fondo del serbatoio. Il mantenimento della sterilità durante l'allestimento del circuito è fondamentale per il successo di questa procedura. Pertanto, tutte le parti devono essere sterilizzate e si devono indossare guanti sterili per tutta la durata dell'operazione.

Oltre alle parti assemblate, queste parti devono essere sterilizzate. Una camera di flusso completa, tre segmenti di tubo flessibile di due pollici ciascuno, un raccordo maschio e uno femmina da un ottavo di pollice, quattro viti a testa piatta da un mezzo pollice, 6 5 16 pollici, otto da trenta secondi. Pollici di pista per pollice, viti a testa piatta, una coppia di pinzette, un vetrino, e due strofinacci sterilizzati a vapore.

Autoclavaggio a 121 gradi Celsius per 60 minuti. Posizionare il circuito di flusso, la camera di flusso, i rubinetti a quattro vie uno per uno, il rubinetto e tutte le parti sterilizzate su questo campo sterile. Indossando guanti sterili, collegare i due rubinetti a quattro vie.

Mettere i tappi sui porti di campionamento aperti. Staccare gli adattatori maschio e femmina che collegano i due tratti di tubo flessibile del circuito di flusso e inserire le valvole a saracinesca collegate. Collegare il tubo flessibile inserito nel serbatoio a una siringa da 30 millilitri e rimuovere il pistone della siringa.

Riempire il flacone con 125 millilitri di mezzo EPC. Ricollegare il tubo flessibile al rubinetto a tre vie. Inserire un filtro sterile per siringa nel foro di ventilazione.

Ora trasferire il circuito di flusso in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Fissare il tubo rigido nella testa della pompa peristaltica Master Flex indicata per l'uso con questo tipo di tubo Palmer in carbone. Assicurarsi che il tubo non si sovrapponga alle guide di montaggio della pompa a rulli.

Segnare il tubo nel punto in cui esce dalla testa della pompa su entrambi i lati con un pennarello. Dopo aver verificato che tutti i rubinetti a chiusura siano chiusi verso i porti del campione e aperti lungo il circuito di flusso, avviare la pompa. Verificare il senso del flusso.

Il PERFUSE otto deve scorrere dal serbatoio di vetro attraverso il tubo rigido fino allo smorzatore di pulsazioni. Per il montaggio della camera di flusso, utilizzare guanti sterili per collegare un segmento di tubo flessibile da due pollici a un adattatore femmina da un ottavo di pollice. Collegare un altro segmento di tubo flessibile da due pollici a un adattatore maschio da un ottavo di pollice.

Collegare il tubo morbido da due pollici con adattatore femmina a baionetta al porto di ingresso e il tubo morbido da due pollici con adattatore maschio a baionetta al porto di uscita. Collegare rubinetti a quattro vie a entrambi questi adattatori a baionetta. Collegare il rimanente pezzo di tubo morbido da due pollici al connettore del porto laterale proveniente dal trappola bolle e fissare un rubinetto unidirezionale utilizzando pinze sterili.

Rimuovere il vetrino con cellule seminate dal contenitore di coltura cellulare e posizionarlo nella cavità della piastra inferiore della camera a flusso. Assicurarsi che il vetrino sia posizionato con il lato contenente le cellule rivolto verso l'alto; utilizzando una siringa o una pipetta, aggiungere 10 millilitri di mezzo EPC caldo sopra il vetrino con le cellule. Lasciare che il mezzo ricopra il vetrino all'interno della camera a flusso, senza farlo traboccare sull'O-ring presente sulla piastra inferiore.

Posizionare la piastra superiore della camera di flusso sulla piastra inferiore, allineando i fori delle viti. Mantenere le due piastre parallele per evitare di introdurre bolle d'aria nella camera avvitando le piastre insieme. Utilizzando un cacciavite elettrico a batteria, eliminare la bolla nel trappola di spurgo in ingresso aprendo il rubinetto unidirezionale collegato alla porta della trappola di spurgo del lato di ingresso.

Utilizzare una siringa da 10 millilitri per lavare delicatamente il tubo di ingresso con il mezzo EPC, quindi chiudere e tappare questo rubinetto a tre vie. A questo punto, eliminare l'aria dal canale della camera aprendo il rubinetto a quattro vie del porto di uscita e lavando delicatamente con il mezzo EPC attraverso la camera di flusso. Utilizzando nuovamente una siringa da 10 millilitri, tappare tutte le connessioni del rubinetto a quattro vie e chiuderle.

Trasferire la camera di flusso nell'incubatore umidificato con il circuito di flusso assemblato. Fermare la pompa del circuito di flusso chiudendo il circuito. Chiudere i rubinetti nel senso del flusso per prevenire perdite.

Collegare la camera di flusso al circuito di flusso. Dopo aver collegato la camera di flusso al circuito di flusso, aprire i rubinetti a tre vie nel senso del flusso. Riavviare la pompa di flusso ed assicurarsi che il flusso di PERFUSE eight proceda nella direzione corretta. Regolare la portata alla tensione di taglio desiderata.

Durante l'esperimento di flusso, la camera di flusso può essere rimossa dal circuito per osservare le cellule mediante microscopia ottica o fluorescenza. Per fare ciò, scollegare la camera di flusso dal circuito di flusso alle connessioni tra i rubinetti a spillo. Per raccogliere il perfusato, prelevare otto campioni per l'analisi.

Prima di tutto, arrestare la pompa e chiudere il rubinetto a tre vie situato più vicino allo smorzatore di pulsazioni. Rimuovere il suo cappuccio protettivo, posizionandolo capovolto per assicurarsi che non si contamini. Inserire una siringa piccola nel porto di campionamento.

Chiudere il rubinetto a chiusura rapida nella direzione della camera di flusso, mantenendo aperti il portello del campione e il circuito in direzione dello smorzatore di impulsi. Aspirare la quantità desiderata di campione dal circuito, quindi chiudere il rubinetto verso il portello del campione prima di rimuovere la siringa. Conservare il campione in abbondanza in un vial etichettato e congelare a meno 80 gradi Celsius.

Richiudere il porto del campione e assicurarsi che tutti i rubinetti a tre vie siano aperti prima di avviare il flusso. Utilizzando questo metodo, cellule progenitrici endoteliali derivate da sangue umano possono essere seminate su vetrini di titanio entro 15 minuti e aderire sotto forze di taglio fisiologiche. Come mostrato in questa figura, le CPE si espandono sotto l'influenza del flusso da circa 210 micrometri quadrati immediatamente dopo la semina a circa 657 micrometri quadrati dopo tre ore e a circa 1.152 micrometri quadrati dopo 48 ore di stress da taglio del fluido pari a 15 din/cm².

Questa immagine al microscopio ottico illustra l'orientamento casuale degli EPC umani. Dopo un periodo di adesione statica di sei ore a seguito di tre ore di flusso a 100 din/cm², le cellule si sono espanse ma rimangono orientate in modo casuale. Dopo 48 ore di stress da flusso a 100 din/cm², gli EPC si allineano e orientano nella direzione del flusso.

Qui, le EPC sono state marcate con CTO e i nuclei cellulari colorati con herx prima della morte dopo il passaggio in flusso. A scopo comparativo, questa immagine mostra EPC suine su vetrini di titanio allineate nella direzione del flusso. Dopo 48 ore di flusso ed esposizione a uno stress di taglio di 15 dine per centimetro quadrato, i bordi cellulari sono stati colorati con il marcatore anti pcam e i nuclei con il colorante nucleico cytoxin.

Questo metodo consente inoltre di ottenere campioni del PERFUSE otto in intervalli di tempo predeterminati per l'analisi e/o la quantificazione dei metaboliti cellulari secreti. Qui viene mostrato un esempio della produzione di nitrito durante un esperimento di flusso della durata di 48 ore con EPC porcini. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale mantenere l'asepsi per tutto il tempo.

Inoltre, è importante adottare le misure necessarie per ridurre il numero di bolle d'aria nella camera di flusso prima dell'inizio del flusso continuo, poiché potrebbero staccare le cellule. Raccomandiamo inoltre di controllare ogni singola connessione nella camera di flusso e nel circuito prima della perfusione per evitare perdite di PERFUSE eight durante un esperimento. Questa camera è progettata con O-ring integrati che consentono un perfetto accoppiamento tra la piastra superiore e quella inferiore e garantiscono una tenuta ermetica senza la necessità di pompe a vuoto.

Questa caratteristica garantisce anche un'altezza costante della camera tra un esperimento e l'altro ed elimina la necessità di guarnizioni di gomma o regolazioni. La nostra camera a flusso utilizza vetrini da microscopio standardizzati. Pertanto, un elevato numero di cellule è disponibile per ulteriori esperimenti.

Ad esempio, l'RNA e il DNA delle cellule dopo il flusso possono essere valutati per la sintesi proteica o l'espressione genica. Il nostro design del circuito consente la raccolta di otto campioni di perfusione per l'analisi e la quantificazione di metaboliti cellulari come il nitrito, un metabolita ossidativo primario dell'ossido nitrico, secreto dalle cellule sotto stress da taglio fluidodinamico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come assemblare la nostra camera a flusso e il circuito a flusso sterile per sottoporre cellule aderenti a uno stress da taglio fluidodinamico.