Sinapsi Presynaptically silenzioso studiato con microscopia ottica

Alcuni terminali presinaptici nel sistema nervoso centrale risultano non funzionali o silenziosi. Presentiamo qui un protocollo per l'identificazione dei terminali presinaptici silenziosi. Questo protocollo può essere applicato per identificare trattamenti e manipolazioni sospettati di silenziare o risvegliare tali terminali.

Il protocollo combina l'etichettatura con colorante vitale delle vescicole sinaptiche durante la depolarizzazione neuronale con una successiva etichettatura di cellule fissate mediante un anticorpo che marca tutti i terminali presinaptici, sia silenziosi che attivi. Le sinapsi doppio-etichettate con colorante e anticorpo sono attive. Le sinapsi etichettate solo con l'anticorpo sono silenziose.

Ciao, sono Amanda Taylor del laboratorio del Dottor Steve Minick del Dipartimento di Psichiatria della Washington University School of Medicine. Sono anche Shahin, del Manic Lab. Oggi vorremmo mostrarvi il procedimento per visualizzare i terminali presinaptici silenti utilizzando neuroni dell'ippocampo in coltura.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare come l'attività elettrica e le altre vie di segnalazione singole modulino il rilascio di neurotrasmettitori. Cominciamo dunque. In una cappa a flusso laminare sterile, utilizzare HIPA non acquistabile da ratti o topi del giorno postnatale zero fino al terzo giorno per preparare colture cellulari dissociate.

Secondo il nostro protocollo pubblicato, le nostre colture sono colture gliali miste derivate dalle stesse cellule di dissezione che devono essere seminate in piastre sterili da 35 millimetri. Ciascuna contenente un'ogiva numero zero rivestita con cinque milligrammi per millilitro di collagene. I neuroni a una densità approssimativa di 500 cellule per centimetro quadrato.

12 cuccioli di ratto produrranno tipicamente da 30 a 35 piatti da millimetro. Lasciare crescere le colture in un incubatore per colture per 10-14 giorni. Per lo sviluppo e la maturazione sinaptica, aggiungere l'antimitotico a C per arrestare la crescita gliale al quarto giorno in vitro.

Inoltre al quinto giorno in vitro, effettuare un parziale cambio di mezzo con mezzo neurobasale aggiunto del supplemento B 27 per migliorare la sopravvivenza neuronale durante questo periodo di maturazione. Introdurre trattamenti che modificano il numero di sinapsi silenti presinaptiche. Si è scoperto che un modo pratico per silenziare una grande percentuale di sinapsi glutammatergiche è un trattamento di quattro ore con 30 millimolari di potassio.

Quando le colture sono mature, i neuroni dovrebbero presentare una densità relativamente bassa con prolungamenti neuritici ben separati ed estesi. Rimuovere le colture dall'incubatrice e portarle sul banco di lavoro. Sostituire il mezzo di coltura con una soluzione salina tamponata contenente 45 millimolar di cloruro di potassio e 10 micromolar di colorante FM 1 43 FX.

Questa soluzione dovrebbe contenere anche NBQX e A PV per prevenire la segnalazione ricorrente. È importante che la soluzione madre di FM 1 43 FX e gli esperimenti siano mantenuti al buio per evitare il fotobiancamento. Coprire quindi le piastre di coltura con stagnola per tutti i successivi passaggi di incubazione.

Incubare esattamente per due minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di colorante e lavare solo per tre-cinque secondi in salina tamponata con 500 micromolar adversive.Seven. Per rimuovere il colorante non specifico, i tempi di questa fase sono critici.

Un'esposizione prolungata all'adv adverse F7 rimuoverà tutte le marcature con FM 43 FX. Quindi lavare le cellule con soluzione salina tamponata senza adv adverse, sette volte per intervalli di due minuti ciascuno, in una cappa chimica.

Fissare le colture in paraformaldeide al 4% e glutaraldeide allo 0,2% in PBS per 10 minuti. Lavare brevemente le cellule con PBS. A questo punto, le cellule possono essere spostate fuori dalla cappa chimica.

Aggiungere una soluzione di blocco contenente siero di capra normale al 4% e Triton X allo 0,04% per ridurre il fondo e permeabilizzare le cellule per la colorazione immunoistochimica. Incubare per 15 minuti. Colorare le cellule con l'anticorpo primario vlu T diluito a 1:2000 nella soluzione di blocco.

Incubare le colture con l'anticorpo con agitazione delicata per tre ore. Lavare le cellule quattro volte con PBS. Incubare le cellule con Alexa.

Anticorpo coniugato anti-criceto diluito 1:500 nella soluzione di blocco. Mantenere le colture nell'anticorpo secondario con agitazione delicata per 30 minuti. Lavare le cellule altre quattro volte con PBS.

Posizionare una piccola goccia del campione sul vetrino pulito utilizzando pinzette. Prendere un coprioggetto e abbassarlo delicatamente sulla goccia di cellule del campione rivolte verso il vetrino. Lasciare asciugare il vetrino tutta la notte.

Preparare un obiettivo ad immersione ad olio da 60x su un microscopio confocale a scansione laser. Posizionare un vetrino sul portacampioni in modo che il coprioggetto sia rivolto verso l'obiettivo. Individuare un campo di neuriti non eccessivamente denso e lontano dal soma, che potrebbe trattenere il colorante residuo.

Zoomare su un campo di dimensioni pari a 51 per 51 micron. Utilizzando un software di acquisizione delle immagini, acquisire uno stack ZS che copra una profondità di 7,8 micron in 27 passi da 0,3 micron ciascuno.

Scansionare prima con l'anticorpo VLU T uno per identificare tutte le sinapsi glutammatergiche nel campo. Successivamente, rieseguire la scansione per la fluorescenza di FM 1 43 FX per analizzare le immagini dopo l'acquisizione. Utilizzare un software di analisi per convertire la serie Z in un'immagine composita a singolo piano basata sulla lettura dell'intensità massima proveniente da qualsiasi piano per ogni soglia stabilita dei pixel.

Per ridurre il fondo, identificare le terminazioni VGluT1 senza fare riferimento alla colorazione con il tracciante FM 1-43 e marcare questi punti come regioni di interesse. Di solito si selezionano 10 punti per campo.

Ripetere la sogliatura e la selezione delle puncta sull'immagine degli effetti di FM 1-43 e sovrapporre le immagini per identificare le sinapsi silenti. Per distinguere le sinapsi attive positive per FM 1-43 da quelle inattive negative per FM 1-43, può essere utilizzato un criterio assoluto di pixel oppure un criterio percentuale di pixel. Nelle nostre colture, osserviamo che dal 70 all'80% delle sinapsi glutamatergiche definite dalla colorazione per Vglut1 mostra una colorazione rilevabile per FM 1-43 nelle immagini sovrapposte della fluorescenza verde di FM 1-43 e della colorazione rossa per Vglut1.

Questo è evidente come un'elevata quantità di sinapsi puntiformi gialle con marcatori co-localizzati. Queste sono indicate dalle frecce. Approssimativamente dal 20 al 30% delle puncta positive per Vglut1 rosse non presenterà fluorescenza verde di FM 1-43 al di sopra della linea di base.

Questi sono i terminali presinaptici inattivi e un esempio è indicato dalla freccetta. Sarà inoltre osservata una terza popolazione di sinapsi. Queste risultano positive per la fluorescenza verde di FM 1 43, ma prive di colorazione rossa per B glut uno.

Queste sono sinapsi GABAergiche attive e un esempio è indicato dall'asterisco. Queste vengono escluse dalla maggior parte delle nostre analisi, ma possono essere studiate esplicitamente utilizzando un anticorpo contro il trasportatore vescicolare di GABA. Al posto dell'anticorpo VLU T uno, abbiamo appena mostrato come visualizzare le sinapsi silenti presinaptiche utilizzando la colorazione con FM 1-43 e l'immunomarcatura per VLU uno.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che FM 1 43 FX è sensibile sia al tempo nel lavaggio adver sub seven sia alla concentrazione di X 100 presente nella soluzione di blocco. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.