Realizzazione e di funzionamento di un Inserto di ossigeno per colture cellulari aderenti

Il dispositivo con inserto ipossico presenta sei pilastri che si incastrano nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Il gas scorre attraverso la rete microfluidica alla base del pilastro e può diffondere attraverso la membrana di PDMS permeabile ai gas, che separa la rete gassosa dal mezzo di coltura. Questo dispositivo riduce al minimo la lunghezza del percorso di diffusione tra la sorgente di ossigeno, la rete microfluidica alla base del pilastro e le cellule, consentendo un'equilibratura più rapida della concentrazione di ossigeno.

Il dispositivo consente anche un controllo molto maggiore sul modello spaziale di ossigeno a cui le cellule sono esposte, il quale è determinato dalla progettazione della rete gassosa microfluidica realizzata mediante fotolitografia standard utilizzando maschere fotolitografiche. Ciao, sono Sean Ard del laboratorio del Dott. David Edington del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università dell'Illinois a Chicago. Ciao, sono Ellie, anch'io del Laboratorio Edington.

Oggi vi mostreremo come realizzare, convalidare e utilizzare un dispositivo personalizzato per esporre colture cellulari in vitro in una piastra a sei pozzetti a diverse concentrazioni di ossigeno. Abbiamo utilizzato questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'effetto dell'ossigeno sulla guarigione delle ferite, sulla produzione di specie reattive dell'ossigeno e sulla migrazione cellulare. Cominciamo dunque.

Per iniziare la fabbricazione dell'inserto ossigenante, preparare il Polymethyl Sloane o il PDMS in un rapporto 10 a 1 tra prepolimero e agente indurente. Secondo le istruzioni del produttore, la miscela di PDMS viene aggiunta a uno stampo in Dell ran precedentemente lavorato, sagomato per riprodurre la forma di una piastra per colture standard a sei pozzetti. Dopo la polimerizzazione a 75 gradi Celsius per tutta la notte, l'array di pilastri ottenuto per stampaggio formerà il primo dei tre componenti che costituiscono l'inserto ossigenante, al fine di fabbricare il secondo componente principale dell'inserto ossigenante.

Un master in SU-8 è preparato innanzitutto centrifugando l'SU 8 21 50. Su un wafer di silicio viene applicata una maschera fotolitografica e l'SU-8 viene esposto ai raggi UV attraverso la maschera per creare un modello master con uno spessore di microcanale di 300 micrometri. Versare il PDMS sopra il master in SU-8 e polimerizzare per due ore a 75 gradi Celsius per ottenere un calco positivo che formerà infine i microcanali alla base di ogni pilastro.

Il terzo componente del dispositivo viene realizzato centrifugando il PDMS su una piastrina di silicio a 500 giri/min per 10 secondi, seguiti da 900 giri/min per 30 secondi, al fine di ottenere una membrana spessa 100 micrometri. Poiché il PDMS è permeabile ai gas, l'ossigeno può essere fornito direttamente nei microcanali attraverso questa membrana. Una volta preparati tutti i componenti, ogni superficie di incollaggio viene sottoposta a un trattamento con plasma di ossigeno per un minuto.

Utilizzando un dispositivo al plasma portatile, incollare innanzitutto i sei componenti dei microcanali all'array di pilastri, quindi praticare due fori in ciascun pilastro da utilizzare come ingressi ed uscite del gas. Infine, incollare la membrana alla base del microcanale per facilitare l'incollaggio ed espellere eventuali bolle d'aria. Le superfici trattate al plasma vengono premute insieme per circa un minuto utilizzando l'estremità piatta di una pinzetta; attendere un'ora tra ciascun incollaggio per assicurare che il dispositivo sia completamente incollato e possa essere calibrato.

Dopo aver realizzato un dispositivo completo, è necessario calibrare il livello di ossigeno ricevuto dalle cellule durante l'utilizzo dell'inserto ossigenante in esperimenti effettivi. Per la calibrazione, utilizzare un sensore fluorescente di ossigeno o una lamella Foxy, che contiene un rivestimento fluorescente a base di colorante al rutenio il cui segnale viene attenuato dall'ossigeno. Le lamine Foxy sono già tagliate su misura per adattarsi al fondo di una piastra a sei pozzetti.

La lamella di fox deve essere tagliata in modo da coprire il più possibile la superficie del pozzetto. Poiché la lamella di fox ha uno spessore di circa un millimetro, modificare il dispositivo per mantenere la distanza desiderata per una adeguata diffusione della membrana.

Questa distanza dipende dall'esperimento, ma nella maggior parte dei casi dovrebbe essere inferiore a un millimetro utilizzando il dispositivo a plasma portatile per incollare un vetrino microscopico spesso un millimetro. Fissare sul fondo del dispositivo dei supporti lunghi circa sei millimetri e larghi quattro millimetri. Il dispositivo poggia sui supporti posti sopra il vetrino tagliato.

Le lamelle di vetro possono essere utilizzate anche per un intervallo di diffusione di 0,17 millimetri al fine di convalidare il consumo di ossigeno. Aggiungere tre millilitri di acqua deionizzata a temperatura ambiente nei pozzetti della piastra a sei pozzetti in cui verrà misurato l'ossigeno. Posizionare il dispositivo nella piastra e, utilizzando il software Metamorph, selezionare il numero e la posizione dei punti desiderati sul sensore Foxy.

Fai scorrere per eseguire il dosaggio delle concentrazioni di ossigeno. Collega il tubo del regolatore al serbatoio di gas ossigeno e al dispositivo ipoxico. Si utilizza un regolatore di flusso di precisione impostato su un flusso di 50-100 millilitri al minuto per un controllo accurato del gas erogato.

Assicurarsi che il regolatore di flusso preciso sia chiuso. Aprire prima il regolatore superiore della bombola, seguito dal regolatore di precisione. Ridurre la portata a tra 10 e 20 al minuto dopo 15 minuti.

Per evitare la formazione di bolle nell'acqua, osservare attentamente il valore della portata nell'ora successiva ed effettuare le regolazioni necessarie, poiché la caduta di pressione cambierà durante l'equilibrazione del sistema, modificando così la portata per acquisire immagini della piastra e dei sensori foxy. Si utilizza un microscopio Olympus IX71 dotato di fluorescenza, una telecamera a dispositivo a accoppiamento di carica di Q Imaging Tiga, SRV e il software di acquisizione immagini Metamorph. Il microscopio è dotato di un filtro fluorescente Olympus 3 1 0 2 0, compatibile con foxy, con una lunghezza d'onda di eccitazione di 475 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 600 nanometri.

Per verificare il tempo di equilibrazione e il grado di ossigenazione del dispositivo, scegliere tre punti sullo slide foxy in cui misurare la concentrazione di ossigeno. Acquisire un'immagine dello slide immediatamente prima di avviare il flusso di gas. Acquisire immagini a intervalli di 10 secondi per 30 minuti mentre il gas scorre attraverso il dispositivo, al fine di verificare l'eterogeneità e il rilascio di ossigeno.

Stabilire più punti a intervalli di un millimetro lungo tutta la larghezza del canale e misurare la concentrazione di ossigeno sulla superficie della pozzetta utilizzando Metamorph. Esportare l'intensità media dell'immagine per ciascuna posizione e tracciare la concentrazione di ossigeno in funzione dell'intensità di fluorescenza. Generare una curva di calibrazione adattando curve lineari alla linea da 0 a 10% e alla linea da 10 a 21%, che correlano l'intensità di fluorescenza alla concentrazione di ossigeno. Per ciascuna posizione misurata, i dati grezzi di intensità possono essere esportati da Metamorph e analizzati ulteriormente con Microsoft Excel o altri software statistici.

Dopo aver calibrato il dispositivo, è possibile iniziare esperimenti come i saggi di guarigione delle ferite: sterilizzare l'inserto calibrato in autoclave a 121 gradi Celsius per 15 minuti entro 24 ore prima dell'esperimento e manipolarlo all'interno di una cappa a flusso laminare per prevenire contaminazioni successive. Immergere l'inserto in PDMS sterilizzato in un mezzo privo di siero per 24 ore per evitare la formazione di bolle di gas durante l'inserimento nei pozzetti della piastra. Coltivare cellule MDCK o altre cellule aderenti fino a raggiungere una confluenza del 100% in una piastra a sei pozzetti ed eseguire graffi lineari nei monociti utilizzando la punta di una pipetta P200. I graffi simulano ferite nel monocito aderente.

Aspirare il terreno cellulare senza disturbare il monostrato e risciacquare con cinque millilitri di terreno. Aspirare nuovamente e riempire nuovamente le pozzette con tre millilitri di terreno privo di siero. Inserire delicatamente il dispositivo nella piastra, assicurandosi di evitare bolle d'aria.

Inclinare il dispositivo durante l'inserimento aiuta a espellere le bolle da un lato. Prestare attenzione a non esercitare una pressione eccessiva sul dispositivo, che potrebbe deformare il PDMS a sufficienza da schiacciare le cellule sottostanti. Posizionare la piastra e il dispositivo su un palco microscopico riscaldato a 37 gradi Celsius e collegare i tubi provenienti dalla bombola del gas alla porta di ingresso e a quella di uscita del dispositivo.

L'incubatore per colture deve avere un foro per permettere l'inserimento del tubo, e il tubo deve essere collegato. Dopo aver posizionato il dispositivo nell'incubatore, seguire la stessa procedura descritta in precedenza per avviare il flusso di gas. Acquisire immagini in time-lapse delle cellule ogni 20 minuti per un periodo di 15-18 ore, utilizzando l'equipaggiamento e il software di imaging descritti in precedenza. Per analizzare l'area superficiale non guarita al termine del periodo sperimentale desiderato, si può utilizzare un algoritmo di misurazione della ferita. Arrestare il flusso di gas, rimuovere la piastra ed eseguire ulteriori procedure di lavorazione delle cellule, se necessario. Il dispositivo con inserto ipossico richiede meno di due minuti per stabilizzarsi al 0,5% di ossigeno, come mostrato qui.

La dimensione dello spazio tra il fondo del pozzetto e la membrana del dispositivo era un fattore critico nel determinare l'efficienza di equilibrazione, con spazi maggiori che richiedevano più tempo per raggiungere valori stazionari di concentrazione di ossigeno. Il dispositivo consente inoltre un notevole controllo sulla distribuzione spaziale dell'ossigenazione all'interno di un singolo pozzetto, permettendo la formazione di diverse condizioni e persino generando un profilo ciclico di ossigenazione lungo la superficie del pozzetto. Monolayer di cellule MDCK sono stati esposti a un'ossigenazione del 10% o del 21% e l'area superficiale della ferita è stata analizzata nel tempo mediante l'algoritmo MATLAB Ts per l'analisi della chiusura della ferita da graffio.

Dopo 11 ore su un totale di 17 ore, il 6,87% della ferita originale era rimasto esposto a un'ossigeno al 10%, mentre il 64,4% della ferita era rimasto a un'ossigeno al 21%. Come mostrato qui, le concentrazioni di ossigeno sono inversamente correlate all'area aperta della ferita per entrambe le concentrazioni di ossigeno. Per tutta la durata dell'esperimento, vi abbiamo appena mostrato come fabbricare, convalidare e utilizzare il dispositivo con inserto ipossico per un saggio di guarigione della ferita da graffio. Il dispositivo offre diversi vantaggi rispetto ad altri sistemi di ossigenazione, come un ingombro minore in laboratorio e un controllo molto maggiore sull'ossigenazione spaziale e temporale alla superficie cellulare.

Il dispositivo può essere utilizzato da praticamente qualsiasi laboratorio che studi l'effetto dell'ossigeno o di altri gas, come l'anidride carbonica, sulle colture cellulari in vitro. Durante questa procedura, è importante immergere il dispositivo sterilizzato e i mezzi di coltura per tutta la notte, minimizzare la formazione di bolle durante l'esperimento e lasciare che il sistema raggiunga l'equilibrio prima di iniziare l'esperimento.

Ciò accade perché la portata cambia quando la pressione nel sistema si equilibra. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.