Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso corretto dei vasi Corning Hypers in sistema chiuso. Questo viene realizzato innanzitutto inoculando e riempiendo i vasi con il mezzo di coltura mediante il metodo a flusso per gravità. Successivamente, la sospensione cellulare viene isolata in ciascuno strato e le cellule vengono incubate.

Dopo l'incubazione, il mezzo usato viene rimosso. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel raccogliere le cellule dai vasi dello stack hypers. Alla fine, si ottengono i risultati sulla diffusione dei gas per dimostrare la capacità delle cellule di accedere all'ossigeno durante la crescita fino alla confluenza quando si utilizza il sistema chiuso dello stack hypers.

Il principale vantaggio del vaso Hypers Stack con materiale permeabile ai gas è che fornisce una superficie maggiore per la crescita cellulare. Eliminando lo spazio di testa nel vaso, il mio collega p pardo illustrerà ora un protocollo in sistema chiuso per l'utilizzo del vaso Hypers Stack. Il vaso Hypers Stack è composto da uno stat, ovvero il singolo compartimento per coltura cellulare costituito dalla piastra superiore e dal film permeabile ai gas.

Le cellule vengono coltivate all'interno di questo compartimento. Il collettore liquido collega ciascuno degli strati tra loro all'interno di un modulo. I moduli sono collegati mediante tubi per formare vasi multipli di 12 strati.

Il collettore consente all'utente di effettuare una singola manipolazione del fluido per l'intero dispositivo. Il collettore d'aria collega inoltre i vari strati stat tra loro, ma viene utilizzato per spostare l'aria dal dispositivo durante l'aggiunta di fluidi e contiene una linea di riempimento da utilizzare durante il riempimento tra ciascuno strato. Ogni strato stat è uno spazio aperto a contatto con l'aria, chiamato spazio tracheale, che permette lo scambio gassoso attraverso il film permeabile ai gas di ciascuno strato.

Il tubo per la manipolazione dei liquidi è collegato al collettore dei liquidi ed è una componente personalizzabile utilizzata per effettuare tutte le manipolazioni dei fluidi in sistema chiuso, rilasciando l'aria in eccesso mantenendo al contempo la sterilità. Viene utilizzato il tubo di sfiato. Il tubo di sfiato è collegato al collettore dell'aria e contiene un filtro per l'aria.

Collegato al tubo per la movimentazione del liquido vi è il tubo di spurgo e il filtro, utilizzati per rimuovere il fluido dal tubo di movimentazione del liquido dopo il riempimento del vaso. In questo protocollo viene inoltre utilizzato il manipolatore Corning Stack (CSM), un dispositivo di manipolazione che agevola il posizionamento corretto dei vasi durante l'uso. In questa dimostrazione, la coltura cellulare in sistema chiuso viene illustrata per un vaso a 36 strati permeabile ai gas.

Utilizzando un CSM, tuttavia, i dettagli per eseguire questa procedura su un vaso a 12 strati utilizzando una cuneo di riempimento sono disponibili nel protocollo scritto allegato. Preparare innanzitutto 3,9 litri di terreno in sacchetto prima di inoculare il tubo di terreno. Collegare il sacchetto di siero al sacchetto di terreno e mescolare accuratamente per ottenere la concentrazione desiderata di siero.

Chiudere con mollette da sacca circa 300 millilitri di mezzo nel sacco utilizzando mollette grandi. Questo garantisce che tutte le cellule inoculate vengano utilizzate durante il riempimento e che non ne rimangano nel sacco del mezzo. Posizionare il mezzo su un supporto per sacche per inoculare il mezzo.

Riempire una siringa collegata a un tubo con la sospensione cellulare. Collegare la siringa contenente la sospensione cellulare al sacchetto per il mezzo mediante saldatura del tubo. Tre pollici e sedici del tubo dalla siringa al sacchetto.

Iniettare la sospensione cellulare nel sacchetto del mezzo e mescolare bene. Il sacchetto del mezzo inoculato può essere collegato al tubo per il travaso di liquidi da tre ottavi di pollice del recipiente mediante saldatura di tubi o l'utilizzo di connettori multifunzione. Oggi utilizzeremo la saldatura di tubi.

Chiudere le pinze sui tubi di prelievo del liquido e sui tubi di spurgo del recipiente. Posizionare il recipiente a 36 strati in un CSM nella posizione di carico. Inserire il tubo del filtro di sfiato nella pinza di fissaggio sul CSM.

Chiudere il coperchio e spostare il CSM nella posizione di riempimento per posizionare il filtro dell'aria nella posizione più alta, evitando così l'inzuppamento durante l'operazione di riempimento. L'angolo di 10 gradi permette inoltre l'equilibrazione del liquido tra gli strati durante il riempimento, eliminando l'aria dalla linea di riempimento. Posizionare il sacco del mezzo alla stessa altezza del recipiente, mantenendo chiusa la pinza del tubo di spurgo.

Aprire la pinza del tubo per il trattamento dei liquidi e la pinza del sacchetto del mezzo per consentire al fluido di entrare nel recipiente. Utilizzando il supporto per sacchetto, sollevare il sacchetto del mezzo per favorire il flusso della sospensione cellulare nel recipiente. Riempire il recipiente fino a quando tutto il mezzo inoculato non sarà entrato nel recipiente.

La parte superiore del sacco del mezzo dovrebbe ancora contenere 300 millilitri di mezzo. Rimuovere la pinza dal sacco del mezzo per continuare a riempire il recipiente quando il liquido si avvicina al collettore d'aria superiore. Ridurre la velocità di riempimento abbassando il sacco del mezzo per evitare un riempimento eccessivo.

Portare lentamente il livello del liquido fino alla linea di riempimento e raggruppare il tubo di trasferimento del liquido. Portare il recipiente nel CSM in posizione di isolamento, posizionando entrambi i gruppi di collettori nella posizione più alta. Abbassare il sacchetto del mezzo al di sotto dell'altezza del recipiente.

Tenendo il filtro di spurgo in posizione verticale, aprire la pinza del tubo di spurgo. Questo farà defluire il mezzo presente nel tubo di manipolazione liquidi nuovamente nel sacchetto del mezzo. Una volta svuotato il tubo, chiudere la pinza sul tubo del sacchetto del mezzo.

Mantenere il filtro del tubo di caccia in posizione verticale. Aprire la pinza sul tubo di gestione del liquido del recipiente per permettere al liquido rimanente di entrare ed equilibrarsi nel recipiente. Attendere uno o due minuti affinché ciò avvenga.

Successivamente, ruotare il contenitore nel CSM in modo che i collettori siano a sinistra. Abbassare il contenitore nella posizione di carico sul CSM. Chiudere le pinze su entrambi i tubi del sistema di trascinamento e di gestione del liquido.

Il sacchetto del mezzo può ora essere rimosso dal recipiente, oppure può rimanere attaccato per essere utilizzato successivamente durante la procedura di raccolta. Per conservare il sacchetto del mezzo attaccato, arrotolare il sacchetto e posizionarlo sotto le fascette di ritenzione nel vassoio di stoccaggio del recipiente. Infine, spostare il recipiente nell'incubatrice. Quando si trasporta il recipiente, prestare attenzione a evitare che del liquido entri nel filtro di ventilazione d'aria.

Questo viene eseguito inclinando leggermente verso l'alto l'estremità del collettore. Per iniziare l'assemblaggio del tubo per la raccolta, saldare insieme la soluzione dell'associazione cellulare e i sacchetti di arresto per formare il complesso del sacchetto di raccolta, assicurandosi che tutte le pinze dei tubi siano chiuse. Rimuovere il recipiente dall'incubatore e posizionarlo nel CSM nella posizione di carico.

Rimuovere il sacchetto del mezzo dai fermi e appenderlo alla borsa. Successivamente, posizionarsi in piedi, stringere il coperchio per fissare il contenitore. Inserire il tubo di sfiato nella pinza di sostegno e spostare il CSM sulla posizione di riempimento.

Assicurarsi che il sacchetto del mezzo sul supporto sia posizionato più in basso rispetto al recipiente. Aprire la pinza sulla tubatura del sacchetto del mezzo e sulla tubatura per la movimentazione del liquido del recipiente per permettere al mezzo di fluire nel sacchetto collegato. Quando il recipiente è circa tre quarti vuoto, modificare le impostazioni del CSM sulla posizione finale di svuotamento.

Quando il contenitore e i tubi per la manipolazione del liquido sono vuoti, sollevare i tubi per far avanzare il mezzo oltre la pinza presente sul tubo del sacchetto per il mezzo esausto. Chiudere quindi sia la pinza sul tubo di manipolazione del liquido sia la pinza sul tubo del sacchetto per il mezzo esausto. Sostituire il sacchetto per il mezzo esausto con l'insieme del sacchetto di raccolta mediante saldatura dei tubi.

Sollevare l'asssemblaggio del sacchetto per la dissociazione cellulare al di sopra dell'altezza del recipiente utilizzando il supporto per sacchetto. Posizionare il CSM sulla posizione di riempimento. Aprire la pinza del tubo della soluzione di dissociazione cellulare e la pinza dell'asssemblaggio del sacchetto di raccolta e trasferire la soluzione nel recipiente.

Al termine del trasferimento, chiudere le pinze sulla tubatura di manipolazione del liquido e sulla tubatura della soluzione di dissociazione cellulare. Successivamente, portare il CSM in posizione di carico tenendo aperto il leva di posizionamento orizzontale. Agitare delicatamente il recipiente da un lato all'altro utilizzando la ruota, distribuendo la soluzione sui livelli cellulari.

Il contenitore può occasionalmente essere riportato nella posizione di riempimento durante l'oscillazione per mantenere una distribuzione uniforme della soluzione. Una volta che la soluzione è stata adeguatamente distribuita, rilasciare la leva sul CSM per bloccare la posizione di riempimento. Lasciare il contenitore in questa posizione per il tempo di dissociazione richiesto per le cellule.

Utilizzare la torbidità come indicatore per determinare il distacco delle cellule. Una volta distaccate, spostare il CSM nella posizione di carico. Aprire la pinza del sacchetto di arresto della reazione e la pinza del tubo per la manipolazione dei liquidi per permettere al mezzo di arresto della reazione di entrare nel recipiente.

Chiudere la pinza sul tubo di trasferimento del liquido. Una volta completato il trasferimento, riportare il CSM nella posizione di carico e tenere la leva di posizionamento orizzontale per oscillare il recipiente da un lato all'altro. Utilizzando il supporto per borsa, abbassare la posizione dell'insieme del sacco di raccolta al di sotto del livello del recipiente.

Regolare il CSM sulla posizione vuota. Aprire la pinza del tubo di movimentazione del liquido del recipiente e trasferire la soluzione cellulare nuovamente nel sacchetto di arresto della reazione. Riportare il CSM in posizione di carico e scollegare l'insieme del sacchetto di raccolta dal recipiente utilizzando un sigillatore per tubi.

Ora la soluzione cellulare è pronta per essere processata nei tradizionali sistemi di crescita cellulare. Con Headspace, l'ossigeno nel mezzo si riduce in media del 50% nell'arco di tre giorni. In coltura, questo grafico mostra la diminuzione dei milligrammi per litro di ossigeno a livello delle cellule nel tempo nello stesso sistema di crescita; il gradiente di ossigeno attraverso un'altezza del mezzo di tre millimetri è quasi del 50% maggiore all'interfaccia tra il mezzo e Headspace rispetto al livello dello strato cellulare.

Viene mostrata la percentuale di ossigeno nello spazio tracheale dello stack iper durante la crescita cellulare. Il grafico indica che, nell'arco di 96 ore, la percentuale di ossigeno tra gli strati, che fornisce a ciascun film permeabile ai gas una base costante, rimane invariata. Questo dimostra la capacità delle cellule di accedere all'ossigeno durante la crescita fino alla confluenza.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riempire e raccogliere il contenuto del recipiente Corning Hypers stack in un sistema chiuso.