Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Salve e benvenuti al Gruppo di Biologia Strutturale e Funzionale delle Membrane. Mi chiamo Martin Caffery. L'obiettivo della nostra ricerca è la membrana biologica, la cui schematizzazione è mostrata nella prima diapositiva: la membrana che circonda la cellula e gli organelli subcellulari, quando presenti, è una struttura molecolarmente sottile, spessa soltanto due molecole lipidiche e disseminata di proteine.

Siamo interessati alla struttura e alle funzioni applicate sia ai lipidi che alle proteine. Tuttavia, ai fini di questa serie di JO, limiterò la mia attenzione alle proteine di membrana. Vogliamo comprendere come queste proteine di membrana svolgono le loro funzioni a livello molecolare per due ragioni.

Prima di tutto, vi è la soddisfazione intellettuale nel sapere come funziona qualcosa. In secondo luogo, conoscendone il funzionamento, proprio come per la vostra bicicletta o automobile, esiste la possibilità di ripararla in caso di malfunzionamento. La progettazione di farmaci è un risultato evidente di questo tipo di attività.

L'approccio che adottiamo per comprendere il funzionamento di una proteina di membrana a livello molecolare consiste nel determinarne la struttura cristallografica. Questo processo richiede di stabilire la posizione nello spazio tridimensionale di tutti gli atomi, o quantomeno di tutti gli atomi non idrogeno che compongono la proteina. Il metodo che utilizziamo a tale scopo è chiamato cristallografia macromolecolare a raggi X, abbreviato in MX.

Qui vediamo un esempio di una proteina di membrana la cui struttura è stata determinata mediante cristallografia a raggi X (MX), per la quale è richiesto un cristallo di qualità elevata della proteina. Come si può immaginare, la determinazione strutturale mediante cristallografia macromolecolare, qui illustrata, comprende numerosi passaggi. Tali passaggi includono tipicamente l'identificazione di un bersaglio proteico di membrana, seguita dalla sua produzione, purificazione e cristallizzazione.

Le misurazioni di diffrazione vengono effettuate sul cristallo utilizzando una sorgente a raggi X da laboratorio o da sincrotrone. I dati di diffrazione vengono elaborati, producendo una mappa di densità elettronica, che viene quindi adattata a un modello molecolare. Il modello, una volta affinato, può essere utilizzato per esplorare il meccanismo d'azione della proteina e per la progettazione di farmaci basata sulla struttura.

L'obiettivo di questo articolo di JOVE è mostrarvi come produciamo cristalli di proteine di membrana di qualità frazionata utilizzando le fasi lipidiche meso con il cosiddetto metodo in meso. Una recente revisione del metodo e del suo campo di applicazione è disponibile nella referenza uno. Il protocollo passo dopo passo che seguiremo qui è descritto in riferimento a un diagramma di flusso che riassume i passaggi coinvolti e il tempo necessario per impostare un'analisi di cristallizzazione di proteine di membrana in meso, mostrato qui.

Questo video illustra i passaggi racchiusi dalle linee rosse tratteggiate. Gli elementi necessari per eseguire la cristallizzazione in meso in modalità manuale sono mostrati qui. Essi includono una soluzione concentrata della proteina di membrana purificata e del lipide per creare il mease ospitante, solitamente monooleato, per rendere più evidente il lipide.

In questo video, sono state utilizzate soluzioni di colorante rosso come precipitante, dispositivi per acqua purificata, punte monouso e una serie di siringhe gastight Hamilton, alcune con aghi rimovibili, un giunto a foro stretto utilizzato per mescolare la soluzione proteica con il lipide al fine di produrre il mease. Un distributore ripetitore Hamilton, vetrini e coprioggetti in vetro. Idealmente, nastro distanziatore doppio adesivo silanizzato e perforato per la creazione di pozzetti, pinzette, tessuti per ghiaccio tritato, una calcolatrice e, soprattutto, il vostro quaderno di laboratorio.

La seguente procedura viene utilizzata per preparare una piastra di cristallizzazione a sandwich di vetro. Per il caricamento, posizionare un vetrino silanizzato sul banco di lavoro. Rimuovere la copertura di carta protettiva da una superficie di una striscia di nastro distanziatore adesivo doppio su entrambi i lati e perforato.

Posizionare il nastro con il lato adesivo rivolto verso il basso a contatto con la superficie del vetrino sotto pressione. Sigillare il nastro al vetrino. Utilizzando un rullo o un matterello, è possibile inserire un foglio di alluminio tra il nastro e il rullo per proteggere la base delle pozzette.

Rimuovere la seconda copertura di carta dal nastro per esporre la sua superficie adesiva superiore. Questa procedura genera una piastra di vetro pronta per il caricamento e successiva sigillatura non appena il caricamento è completato. Posizionare singoli cover slip silanizzati in prossimità della piastra per una sigillatura rapida ed efficiente delle pozzette.

Posizionare il lipide in un blocco a temperatura controllata a 45 gradi Celsius per tre minuti, fino a renderlo fuso. Si noti che il lipide utilizzato è tipicamente mono land. In questo video, al lipide è stato aggiunto un colorante rosso per migliorarne la visibilità durante la fusione.

Preparare due siringhe ermetiche da 100 microlitri Hamilton per l'utilizzo nel passaggio di miscelazione lipidi-proteine, rimuovere l'olio in teflon dalla siringa che conterrà la soluzione proteica. Posizionare accanto ad essa la siringa che conterrà il lipide. In questo caso, il fal viene lasciato al suo posto.

Posizionare l'accoppiatore a foro stretto tra le due siringhe, quindi collegare l'accoppiatore al dito della siringa dei lipidi. Stringere l'accoppiatore alla siringa, ma senza sovrastretto. Rimuovere lo stantuffo dal cilindro della siringa dei lipidi.

Assicurarsi che il lipide sia fuso. Impostare la pipetta su 30 microlitri ed aspirare lentamente 30 microlitri di lipide fuso dal tappo. Il flacone del lipide.

Il lipide deve essere conservato sotto azoto o argon a meno 80 gradi Celsius. Introdurre lentamente nella punta aperta della siringa la maggior quantità possibile di lipide fuso, avendo cura di non creare bolle d'aria.

Inserire lo stantuffo nel cilindro a contatto con il leopardo fuso e avanzare lentamente lo stantuffo lungo il cilindro tenendo la siringa in posizione verticale. Come mostrato, la bolla d'aria intrappolata accidentalmente sale nel processo e viene rilasciata. Ora si ha un tappo di lipidi fusi nel cilindro di cui è necessario determinare con precisione il volume.

Questo può essere fatto leggendo i segni sul cilindro della siringa. In questo caso, il volume è di 23 microlitri, che va registrato nel quaderno di laboratorio. Fai scorrere la pelliccia sull'ago che sporge dal giunto.

Utilizzare lo stantuffo per spingere il lipide fuso lungo la siringa e lentamente, con delicatezza, all'interno dell'ago posto al centro del giunto. Se l'ago è leggermente troppo pieno, si osserverà il lipide che fuoriesce dall'estremità aperta. Arretrando leggermente lo stantuffo, il lipide in eccesso può essere riassorbito nel giunto fino a quando non risulta perfettamente allineato con la punta dell'ago del giunto.

In questo caso, l'unità di accoppiamento della siringa è completamente caricata e pronta per essere combinata con la siringa contenente la proteina. La soluzione deve essere centrifugata a 14.000 G per 10 minuti, da cinque a dieci minuti a quattro gradi Celsius, per rimuovere gli aggregati di grandi dimensioni. Prima di impostare le prove di cristallizzazione, prelevare la soluzione proteica dal secchiello di ghiaccio ed equilibrarla a temperatura ambiente.

Calcolare il volume di soluzione proteica da utilizzare per formare la fase cubica a un'umidità totale o vicina a quella totale per olean a 20 gradi Celsius. L'umidità totale con acqua si verifica a circa il 40% in peso di acqua, come indicato nel diagramma di fase. Ricordare che nella siringa per lipidi è stato caricato 23 di mono con una densità di 0,94 milligrammi per microlitro.

Questo corrisponde a 21,6 milligrammi di lipide, quindi sono necessari 21,6 volte quattro diviso sei, ovvero 14,4 milligrammi o 14,4 microlitri di soluzione proteica. Con una siringa Hamilton da 25 o 50 microlitri, prelevare il volume richiesto di soluzione proteica, trasferire la soluzione sulla punta in teflon dello stantuffo nel cilindro della soluzione proteica. Facendo attenzione ad evitare bolle d'aria, ritirare con cura l'ago e misurare il volume di soluzione proteica nella siringa. Tale volume dovrebbe corrispondere al valore calcolato nel passaggio precedente.

In previsione della combinazione con la siringa caricata con lipidi. Spingere con attenzione la soluzione proteica lungo il corpo della siringa fino a farla affiorare all'estremità aperta. Questo può essere osservato guardando dall'alto attraverso l'estremità terminale del corpo della siringa.

La soluzione proteica di lipina, caricata nelle siringhe, è ora pronta per essere combinata in preparazione per la formazione di Mex. Per fare ciò, avvitare la siringa contenente la proteina all'estremità libera del connettore collegato alla siringa contenente i lipidi. Dopo aver unito le due siringhe mediante il connettore, deve esistere un volume continuo di liquido che si estende dal lipide in una siringa, attraverso il connettore, fino alla soluzione proteica nell'altra siringa.

In previsione della miscelazione, l'unità assemblata viene tenuta con una siringa nella mano destra e l'altra nella sinistra. Viene applicata una coppia a entrambe le siringhe fino al giunto, utilizzando le dita e i pollici di entrambe le mani per assicurare che la tenuta contro le scanalature del giunto rimanga intatta dopo il serraggio. Il dispositivo di miscelazione assemblato a questo stadio può danneggiare l'ALS e causare perdite; un serraggio insufficiente porterà inoltre a perdite.

Si tratta di un'esperienza legata all'inevitabile processo di tentativi ed errori e alla perdita occasionale di campione. Vale quindi la pena esercitarsi con soluzioni di lipidi e acqua o tampone per prendere confidenza con il sistema prima di utilizzare soluzioni proteiche preziose per effettuare il mescolamento. Spingere lo stantuffo sul lato proteico dell'unità di mescolamento fino al suo limite con il pollice o l'indice, facendo fuoriuscire la soluzione proteica dalla siringa proteica attraverso il connettore e nella siringa lipidica. Se l'unità è stata sigillata in modo efficace, questa azione provocherà un movimento uguale e opposto dello stantuffo sul lato lipidico.

Ora si utilizza lo stantuffo sul lato dei lipidi per spingere il contenuto della siringa dei lipidi attraverso il coler e all'interno della siringa delle proteine. Questo processo viene ripetuto numerose volte. A volte sono necessari cento passaggi o più per produrre una fase misa omogenea.

All'inizio del mescolamento, il movimento del materiale avanti e indietro attraverso il giunto può risultare irregolare e a volte è necessaria una forza aggiuntiva per ottenere un mescolamento efficace. Questo fenomeno è previsto. Il mescolamento iniziale è solitamente accompagnato dalla formazione di un'opacità non uniforme nel campione, il che è nuovamente previsto.

Man mano che procede l'omogeneizzazione, la consistenza, percepita in base alla forza necessaria per muovere avanti e indietro gli stantuffi, diventa più uniforme e tipica della fase cubica viscosa, così come l'aspetto visivo della fase cubica emergente. Se le condizioni sono appropriate e si forma la fase cubica, la dispersione dovrebbe apparire otticamente trasparente nel corpo della siringa.

Pertanto, i segni sulla canna della siringa devono essere chiaramente leggibili attraverso la fase meso presente nella canna. Nel caso di proteine colorate, la fase meso assumerà il colore della proteina, ma sarà otticamente trasparente. Un leggero raffreddamento del campione durante il mescolamento, posizionando per un breve periodo la siringa mescolatrice sul ghiaccio, può accelerare l'omogeneizzazione e il raggiungimento della trasparenza.

Tuttavia, è importante non esagerare nel mescolare il campione; si deve fare attenzione ad evitare un'agitazione eccessivamente vigorosa poiché ciò potrebbe provocare un aumento della temperatura del campione a causa del riscaldamento dovuto all'attrito. A questo punto, la fase cubica in misa è stata formata e la proteina è stata reimmobilizzata nel bilayer lipidico. La fase in misa è ora pronta per essere dispensata nei singoli pozzetti delle piastre per la cristallizzazione.

Prima di tutto, tuttavia, la fase meso deve essere trasferita in una siringa Hamilton da 10 microlitri montata su un distributore ripetitore. Iniziare questo processo collegando la siringa al distributore sottile. Caricare la siringa con il meso cubico.

Rimuovere l'ago e lo stantuffo dalla siringa. Lasciare il filtro in teflon al suo posto. Rimuovere il dado di ritenzione dal dispenser con l'aiuto di una moneta piccola.

Con il braccio del meccanismo a scatto completamente ritratto, inserire la siringa senza stantuffo e ago attraverso l'anello di sostegno del dispenser. Sostituire la guarnizione di tenuta con il lato a nodo rivolto verso la siringa e avvitarla saldamente all'estremità aperta della siringa.

È necessario prestare attenzione affinché la siringa sia correttamente centrata nell'anello di sostegno e il corpo sia allineato parallelamente al braccio del dispositivo a scatto. Questi due requisiti possono essere verificati mediante I. Tali condizioni sono importanti perché, se lo stantuffo non scorre liberamente, durante il caricamento si accumulerà pressione all'interno della siringa e potrebbe verificarsi una perdita. Far passare lo stantuffo attraverso l'anello di presa con il dado di bloccaggio, svitato di alcuni giri, e guidare lo stantuffo nell'estremità aperta della siringa.

Premere completamente la leva del meccanismo a scatto per spostare lo stantuffo all'interno del corpo e verificare che scorra liberamente lungo il corpo. Se la vite e la barra di guida sono state allentate, serrare nuovamente e verificare che lo stantuffo si muova liberamente. La siringa per il dosaggio è ora pronta per essere caricata.

Spostare lo stantuffo su un lato dell'unità di miscelazione fino al segno di graduazione corrispondente a zero microlitri. Per trasferire la fase meso nell'altra siringa e nel connettore. Scollegare la siringa vuota con il suo UL ancora in posizione dall'unità di miscelazione e collegare immediatamente la siringa caricata con il connettore all'estremità filettata della siringa dosatrice da 10 microlitri.

Il grado di tenuta con cui viene effettuato l'accoppiamento è fondamentale. Come già osservato, caricare la siringa di dispensazione premendo lo stantuffo della siringa da 100 microlitri in modo che la fase meso passi attraverso il raccordo. Se l'accoppiamento è stretto e lo stantuffo nella siringa di dispensazione scorre liberamente, allora lo stantuffo dovrebbe iniziare a muoversi nella stessa direzione dello stantuffo di caricamento mentre la siringa di dispensazione si riempie.

Scollegare la siringa di carico con il connettore attaccato dalla siringa di erogazione. Fissare un ago corto con punta piatta alla terminazione in acciaio della siringa di erogazione e avvitarlo con cura. Bloccare lo stantuffo al braccio del meccanismo a scatto stringendo il nodo nell'anello di bloccaggio.

Si deve fare attenzione a non stringere eccessivamente il nodo, poiché ciò potrebbe graffiare e deformare lo stantuffo, rendendolo inutilizzabile. È importante che la corsa consentita al braccio del dispositivo a scatto nella condizione di bloccaggio sia limitata a non più di un pollice.

Come mostrato oltre, lo stantuffo tenderà a flettersi e la somministrazione potrebbe fallire. Premere più volte il tamburo a scatto per far avanzare lo stantuffo all'interno del corpo della siringa, riempiendo così il volume morto dell'ago e caricando l'ago stesso. Questo passaggio va ripetuto fino a 10 volte finché non fuoriesce dalla punta dell'ago un filamento continuo della fase mesa.

L'ago è ora pronto per essere utilizzato nell'allestimento dei saggi di cristallizzazione, che devono iniziare immediatamente. Non è consigliabile conservare la fase cubica caricata con la proteina per troppo tempo prima di allestire i saggi di cristallizzazione. Poiché alcune proteine sono instabili nella fase cubica in assenza di precipitante aggiunto, posizionare una piastra di cristallizzazione multipozzetta e un cover slip su una superficie sollevata di alcuni centimetri rispetto al banco per facilitare il caricamento.

Il contrasto ottimale e una visibilità migliorata si ottengono quando la superficie è leggermente scura. Omogeneizzare le soluzioni di precipitante e togliere i tappi dalle provette. Impostare la pipetta per il dispensing del precipitante su un microlitro con la siringa tenuta verticalmente in una mano; utilizzare l'altra mano libera per posizionare la punta dell'ago al centro e direttamente sopra la base del pozzetto.

Punto uno. Premere il pulsante sul dispositivo di dispensazione del dispenser ripetitore per espellere un bolo di mease sulla superficie di vetro. Il volume del bolo è di 200 nanolitri.

Quando si utilizza il dispenser standard a ripetizione con una siringa da 10 microlitri, la punta dell'ago non deve trovarsi a più di qualche centinaio di micrometri dalla base del pozzetto. Per garantire una somministrazione corretta, una consegna riproducibile è facilmente ottenibile. È sufficiente un po' di pratica. Dopo aver caricato i quattro pozzetti adiacenti con il mease, aggiungere un microlitro di soluzione precipitante sulla sommità di ciascun bolus di mease.

Utilizzando due microlitri per pozzetto e punte monouso standard il più rapidamente possibile, posizionare una lamella esattamente sopra le pozzette riempite per coprirle in modo uniforme e ottenere una sigillatura impermeabile. Utilizzare una spatola per applicare pressione sulla lamella nel punto in cui entra in contatto con la superficie adesiva esposta del nastro distanziatore. Il processo di dispensazione del meato e del precipitante può essere ripetuto fino a quando tutte le pozzette della piastra sono state caricate e sigillate.

La piastra è ora pronta per l'ispezione e per l'incubazione. Etichettare chiaramente la piastra ai fini del tracciamento. Le proteine sensibili alla luce vengono generalmente gestite avvolgendo le piastre in fogli di alluminio prima di posizionarle nella camera di incubazione.

Questi possono essere rimossi ed esaminati al microscopio in luce attenuata o con illuminazione di colore appropriato. Posizionare le piastre in una camera controllata termicamente, generalmente a circa 20 gradi Celsius, seguendo una cadenza regolare. Ispezionare le pareti alla ricerca di crescita cristallina utilizzando un microscopio a luce polarizzata con un ingrandimento di 10 o 20 volte.

Obiettivo, il programma utilizzato nel laboratorio degli autori è il seguente: giorno 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 post set. Ispezionare attentamente il bolo mease. Regolare la profondità di messa a fuoco all'interno del campione spesso 140 micron.

L'esame deve essere eseguito sia alla luce normale che tra polarizzatori incrociati: i cristalli incolori di proteine di membrana che crescono nella fase cubica appaiono così alla luce normale. I cristalli incolori di proteine di membrana che crescono in mesofase e osservati con luce polarizzata appaiono così o così; le proteine di membrana naturalmente colorate che crescono in mesofase e osservate alla luce normale appaiono così o così.

I prossimi passaggi nel processo complessivo di determinazione della struttura consistono nel raccogliere e raffreddare criogenicamente i cristalli, e nel registrare ed elaborare la diffrazione a raggi X proveniente da questi ultimi. Questi argomenti sono trattati in articoli JoVE separati all'interno di questa serie.