Cristallizzazione high-throughput di proteine di membrana con il metodo lipidica Bicelle
9 gennaio 2012
Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile che mantengono proteine di membrana (MP) all'interno di un doppio strato lipidico, ma hanno un comportamento unico che facilita la fase di high-throughput screening da robot cristallizzazione. Questa tecnica ha prodotto con successo un certo numero di strutture ad alta risoluzione da entrambe le fonti procariote ed eucariote. Questo video descrive i protocolli per la generazione della miscela lipidica bicelle, incorporando i deputati nella miscela bicelle, la creazione d
Questo video illustrerà un metodo per impostare prove di cristallizzazione ad alto rendimento di proteine di membrana purificate utilizzando cellule B lipidiche. Innanzitutto, le cellule B vengono preparate mescolando un lipide e un detergente; la proteina di membrana purificata viene incorporata nella miscela di cellule B e vengono eseguite prove di cristallizzazione mediante un robot nanolitri e ispezione visiva. L'uso di un microscopio ottico standard rivela la presenza di cristalli.
Una volta formati, i cristalli proteici possono essere estratti e congelati per la raccolta dei dati e la determinazione della struttura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, grazie al comportamento di fase unico delle cellule B, è possibile utilizzare nell'ambiente di laboratorio l'equipaggiamento standard e la robotica disponibili per la cristallizzazione. L'allestimento delle cellule B è una tecnica così semplice da permettere di estrarre la proteina di membrana bersaglio dal micella di detergente e inserirla in un ambiente lipidico.
Questo ti fornisce un insieme completamente nuovo di condizioni da sottoporre a screening. Si tratta di un metodo così semplice, utilizzato con successo su molte proteine di membrana, che non c'è alcun motivo per non provarlo. Il primo passaggio nella cristallizzazione basata su cellule B è la preparazione di una miscela lipidica amfifilica formante cellule B.
Questo processo richiede un notevole sforzo ed è il più lungo da eseguire. Si noti che il completamento potrebbe richiedere diverse ore. Le cellule B possono formarsi in una varietà di combinazioni di amfifili lipidici e in un'ampia gamma di concentrazioni.
Per i punti di partenza suggeriti, consultare la tabella uno nel protocollo scritto allegato. Preparare innanzitutto un millilitro di miscela al 35% di DMPC e Chapo in un rapporto molare di 2,8 a 1. Per fare ciò, pesare 0,26 grammi di DMPC e 0,09 grammi di Chapo in un tubo. Portare il volume a 1,0 millilitro utilizzando acqua deionizzata e vorticare la miscela.
Successivamente, riscaldare la miscela a circa 40 gradi Celsius in un bagno a temperatura controllata fino a quando non assume una consistenza gelatinosa. Posizionare quindi la provetta sul ghiaccio. Il campione dovrebbe tornare allo stato fluido.
Quindi vortexare nuovamente per alcuni minuti, continuando a ripetere i passaggi di riscaldamento, raffreddamento e vortexaggio finché il lipide non sarà completamente disciolto. Si noti che, all'aumentare dei cicli, la miscela potrebbe diventare torbida durante il raffreddamento. La miscela sarà un gel limpido a temperatura ambiente o superiore, e un liquido viscoso su ghiaccio; le provette possono essere conservate a -20 gradi Celsius per un immagazzinamento a lungo termine.
I successivi proteine purificate vengono incorporate nel mezzo per cellule B. Questo è un procedimento semplice che deve essere eseguito nello stesso giorno della cristallizzazione, illustrata nella prossima sezione del video. Scongelare la miscela di DMPC capso nel mezzo per cellule B a temperatura ambiente fino a quando la fase non diventa un gel trasparente.
Collocare la miscela sul ghiaccio per liquefarla, quindi vortexarla brevemente per ristabilire una fase omogenea di linfociti B. Da questo momento in poi, mantenere la miscela di linfociti B e la proteina purificata sul ghiaccio. Questo manterrà i linfociti B in fase liquida, rendendoli adatti al pipettaggio.
Successivamente, aggiungere la miscela di cellule B alla proteina solubilizzata con detergente purificata in un rapporto di uno a quattro, volume su volume. Quindi pipettare delicatamente su e giù fino a quando la soluzione diventa limpida ed omogenea. Se compaiono bolle d'aria, centrifugare brevemente in una centrifuga da banco per farle scomparire.
Incubare la miscela sul ghiaccio per almeno 30 minuti per favorire l'incorporazione completa della proteina nelle cellule. La miscela di proteina e cellule è ora pronta per i test di cristallizzazione. I test di cristallizzazione verranno dimostrati utilizzando un robot di cristallizzazione mosquito.
Raffreddare una piastra da 96 pozzetti con fondo a V ponendola sul ghiaccio. Pipettare la miscela proteina-per-cellula nella piastra per assicurare che la viscosità della soluzione sia minima. Mantenere la miscela proteina-per-cellula sul ghiaccio fino all'ultimo passaggio.
Il robot utilizzato dispone di cinque piattaforme. Posizionare la micropiastra contenente il serbatoio sulla piattaforma tre e il coperchio di cristallizzazione, su cui verranno dispensate le gocce, sulla piattaforma cinque. Successivamente, posizionare la piastra con la proteina per pozzetto sulla piattaforma quattro, quella più vicina alla posizione di dispensazione.
Questo garantisce che la miscela proteina-per-cella sia l'ultima ad essere prelevata dal robot e venga immediatamente rilasciata. Avviare l'esecuzione tramite il software: il robot preleverà prima la soluzione del serbatoio, seguita dalla miscela proteina-per-cella, e le dispenserà sul coperchio sotto forma di gocce, per evitare riscaldamento e aumento della viscosità durante il processo. Non programmare il mosquito per mescolare la soluzione del serbatoio con la miscela proteina-per-cella non appena l'esecuzione è completata.
Rimuovere la piastra proteica con cellule dallo strumento e posizionarla sul ghiaccio. Rimuovere il coperchio dallo strumento e appoggiarlo sulla piastra contenente la soluzione di riserva in modo che le gocce risultino capovolte. Incubare la piastra a 20 gradi Celsius.
Si noti che possono essere testate anche altre temperature per la formazione e l'ottimizzazione dei cristalli. Temperature più elevate inducono la fase lamellare, che presenta il vantaggio di predisporre il ripiegamento della proteina in strati. È possibile eseguire uno screening su temperature comprese tra quattro gradi Celsius e 20 gradi Celsius.
Temperature inferiori a quattro gradi Celsius possono causare la precipitazione dei lipidi per periodi prolungati, il primo e il terzo giorno e settimanalmente in seguito; valutare l'aspetto e la crescita dei cristalli mediante microscopio ottico standard. Qui mostrate sono un'immagine in campo chiaro e un'immagine UV di cristalli a forma di ago osservati nella sola condizione di stress. Non è stata rilevata fluorescenza dai cristalli, indicando un falso positivo in questa immagine.
Un cristallo di forma allungata si è formato quando il metilpropanediolo è stato utilizzato come precipitante. Il cristallo fluoresce debolmente, indicando che potrebbe trattarsi di un cristallo proteico, ma si è rivelato non proteico mediante diffrazione a raggi X. Qui viene mostrato un cristallo osservato circa quattro settimane dopo l’allestimento dei saggi.
La forte fluorescenza sotto luce UV conferma che si tratta di un cristallo proteico. Come hai osservato in questo video. Una volta disponibili le cellule B, possono essere mescolate direttamente con la proteina purificata e, da questo punto in poi, la cristallizzazione procede quasi esattamente come nei protocolli standard basati su detergenti.
Un altro vantaggio distintivo è la possibilità di dopare le cellule B con lipidi specifici ai fini dell'ottimizzazione. Questa tecnica offre davvero molta versatilità ed è così semplice da utilizzare che dovrebbe essere provata in tutti i progetti di cristallizzazione di proteine di membrana.
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Panoramica
Questo video illustra un metodo per impostare prove di cristallizzazione ad alto rendimento di proteine di membrana purificate, utilizzando bicelle lipidiche. La tecnica consente l'inserimento delle proteine di membrana in un ambiente lipidico, facilitando il processo di cristallizzazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Strutturale
- Cristallizzazione di Proteine di Membrana
- Biophysica
Sfondo
- Le bicelle sono miscele di lipidi/amfifili che stabilizzano le proteine di membrana all'interno di un doppio strato lipidico.
- Questa tecnica presenta un comportamento di fase unico, vantaggioso per lo screening ad alto rendimento.
- Ha permesso con successo l'ottenimento di strutture ad alta risoluzione da diverse fonti.
- Per le prove di cristallizzazione possono essere utilizzati apparecchiature di laboratorio standard.
Scopo dello studio
- Illustrare la preparazione di bicelle per la cristallizzazione di proteine di membrana.
- Mostrare come incorporare proteine di membrana nella miscela di bicelle.
- Descrivere il processo di impostazione delle prove di cristallizzazione.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di bicelle mediante miscelazione di lipidi e detergente.
- Incorporazione di proteine di membrana purificate nella miscela di bicelle.
- Prove di cristallizzazione eseguite utilizzando un robot nanolitro.
- Ispezione visiva dei cristalli mediante microscopio ottico standard.
Risultati principali
- Formazione con successo di cristalli proteici dalla miscela di bicelle.
- I cristalli possono essere estratti e congelati per la raccolta dei dati.
- La tecnica consente un uso efficiente dell'equipaggiamento di laboratorio standard.
- Le capacità ad alto rendimento migliorano il processo di cristallizzazione.
Conclusioni
- Le bicelle forniscono un ambiente adeguato per la cristallizzazione delle proteine di membrana.
- Il metodo semplifica il passaggio delle proteine da ambienti detergenti a quelli lipidici.
- Questo approccio può portare a un miglioramento nella determinazione strutturale delle proteine di membrana.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La cristallizzazione delle proteine di membrana rimane un collo di bottiglia nella scoperta di farmaci basata sulla struttura a causa dell'idrofobicità e dell'instabilità delle proteine nei micelle di detergente. Il metodo delle bicelle lipidiche fornisce un ambiente lipidico più simile a quello nativo, che migliora la stabilità della proteina e la qualità dei cristalli, consentendo l'ottenimento di dati strutturali affidabili per la validazione del bersaglio. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica nelle fasi iniziali facilitando approfondimenti ad alta risoluzione sui siti di legame dei farmaci e sugli stati conformazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la determinazione strutturale di proteine di membrana in un ambiente lipidico che preserva meglio la conformazione nativa e i siti di legame per i ligandi.
- Valore operativo: Riduce la necessità di ampie schermate di detergenti fornendo una matrice lipidica standardizzata per i tentativi di cristallizzazione.
- Valore predittivo: Cristalli di alta qualità supportano una modellizzazione accurata delle interazioni proteina-ligando, aumentando la fiducia nelle ipotesi relative al legame con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce cristalli di qualità adatta alla diffrazione che consentono una risoluzione a livello atomico per la progettazione guidata dalla struttura di farmaci.
- Valore operativo: Compatibile con robotica standard per la manipolazione di liquidi in nanolitri, permettendo l'integrazione in linee di cristallizzazione ad alto rendimento già esistenti.
- Scalabilità: La bassa viscosità delle miscele proteina-bicelle facilita l'erogazione automatizzata e riduce gli ostacoli tecnici all'automazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Le strutture ottenute mediante cristallizzazione in bicelle informano la progettazione di inibitori selettivi con profili farmacocinetici migliorati.
- De-risking meccanicistico: Permette la visualizzazione di stati conformazionali rilevanti per la modulazione allosterica e i meccanismi di gating.
- Rilevanza del modello preclinico: Supporta l'ottimizzazione basata sulla struttura di composti promettenti mirati a proteine di membrana associate a malattie provenienti da organismi diversi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo delle bicelle si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto promettente, fornendo dati strutturali che guidano la chimica farmaceutica e la selezione del candidato preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la visualizzazione dell'architettura delle proteine di membrana e dei siti di legame dei ligandi in un ambiente lipidico prossimo allo stato nativo.
- Screening: Genera condizioni di cristallizzazione compatibili con lo screening robotizzato, aumentando la produttività e la copertura delle condizioni.
- Analisi: Fornisce dati di diffrazione a raggi X che permettono di ottenere mappe di densità elettronica per la costruzione accurata dei modelli e la validazione della posizione dei ligandi.
- Ricerca traslazionale: Collega le strutture atomiche a saggi funzionali, consentendo la correlazione tra affinità di legame e perturbazioni strutturali.
- Riutilizzo aziendale: Le formulazioni di bicelle possono essere standardizzate e conservate per un uso ripetuto su diversi bersagli di proteine di membrana, riducendo la variabilità dei reagenti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora il tasso di successo della cristallizzazione delle proteine di membrana imitando l'ambiente del doppio strato lipidico.
- Valore operativo: Utilizza attrezzature di laboratorio standard e robotica, eliminando la necessità di strumenti specializzati per la manipolazione di fluidi ad alta viscosità.
- Valore strategico: Accelera l'identificazione dei composti attivi riducendo il tempo necessario per ottenere la struttura di proteine di membrana particolarmente difficili.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni basate sui dati riguardo al proseguimento o meno dei progetti, grazie a informazioni strutturali affidabili sulla druggabilità del bersaglio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolamento dei lipidi e nella biochimica delle proteine di membrana per ottimizzare i rapporti lipide:detergente e l'incorporazione della proteina.
- Richiede l'accesso a robot per la cristallizzazione e sistemi di incubazione a temperatura controllata per l'allestimento e il monitoraggio dei saggi.
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di preparazione delle bicelle tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità dei risultati di cristallizzazione.
- Comporta l'ottimizzazione della composizione lipidica (ad esempio, rapporti DMPC:CHAPSO) e la selezione di precipitanti per soddisfare le esigenze specifiche di cristallizzazione della proteina.
- È limitato dalla necessità di manipolazione a freddo durante la preparazione, per mantenere la fluidità delle bicelle e prevenire transizioni di fase premature.
