Decifrare Percorsi assonale di gruppi geneticamente definito di neuroni nel tubo neurale Chick Utilizzando In ovo Elettroporazione
2 maggio 2010
Questo video viene illustrato come visualizzare i percorsi assonale di gruppi geneticamente definita di neuroni nel midollo spinale embrionale pulcino utilizzando In ovo di geni reporter sotto il controllo di specifici elementi enhancer.
Ciao, sono Ham del laboratorio del Dottor Review Klar del dipartimento di neurobiologia medica dell'Università Ebraica di Gerusalemme. Ciao, sono Sophie Esman e anch'io provengo da un laboratorio Lars. Oggi vi mostreremo una procedura per l'elettroporazione in vivo e la preparazione del midollo spinale in forma di libro aperto.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le traiettorie assonali di popolazioni neuronali geneticamente definite nel midollo spinale embrionale. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, trasferire uova di pollo white leghorn fecondate da temperatura ambiente a un incubatore umidificato, preferibilmente con vassoi oscillanti, a 37-38 gradi Celsius.
È importante monitorare la temperatura e l'umidità dell'incubatrice per ottenere embrioni vitali e sincronizzati. Gli embrioni di pollo vengono elettroporati quando hanno raggiunto lo stadio di Hamburger e Hamilton (HH) da 18 a 20, che rappresenta una fase ottimale per l'espressione specifica dipendente da enhancer. A questo stadio, la testa è disposta ad angolo retto rispetto al tronco.
Anche allo stadio HH 18-20, dovrebbero essere visibili un'ampia serie di vasi sanguigni extraembrionali, come i vasi delle linee vitali anteriore, posteriore, destra e sinistra. Gli embrioni di pollo raggiungono lo stadio HH 19-20 dopo 66 ore di incubazione; a quel punto, rimuovere le uova dall'incubatrice. Dopo aver rimosso le uova, posizionarle in orizzontale e attendere da cinque a dieci minuti. L'embrione si trova ora al polo superiore dell'uovo.
Prima dell'elettroporazione, preparare gli embrioni in soluzione di Hank contenente 100 unità per millilitro di penicillina e 0,1 milligrammi per millilitro di streptomicina. Preparare una miscela desiderata di DNA a due-cinque microgrammi per microlitro e aggiungere alcuni cristalli di colorante verde brillante per facilitare la visualizzazione del DNA iniettato. Avere a disposizione una pipetta a bocca, un ago sterile per siringa, forbici piccole e del nastro adesivo.
Preparare le micropipette tirando capillari di vetro con diametro di 0,5 millimetri mediante un estrattore di pipette. Inserire gli elettrodi al tungsteno nei micromanipolatori e collegare gli elettrodi al generatore di impulsi. Impostare la tensione del generatore di impulsi a meno 30 volt, la durata di ciascun impulso a 50 millisecondi e il numero di impulsi a tre.
Procedere all'elettroporazione prima di esporre e manipolare gli embrioni. Inserire una siringa al polo stretto dell'uovo ed estrarre da cinque a sei millilitri di albume da ciascun uovo. L'albume viene rimosso per evitare che fuoriesca.
Nel passaggio successivo, durante il taglio, utilizzare le forbici piccole per effettuare il taglio. Aprire una finestra ovale nella parte superiore dell'uovo dopo aver esposto l'embrione di pulcino e inumidirlo con 0,5-1 millilitro di soluzione di Hank contenente penicillina e streptomicina. Successivamente, utilizzare un pipetto a bocca per caricare la microcapillare di vetro.
Con una miscela di colorante per DNA, una microcapillare del diametro corretto dovrebbe caricarsi facilmente con il DNA. In posizione binoculare, posizionare l'embrione per iniettare il DNA nel tubo neurale. Posizionare l'embrione con la coda rivolta verso di voi.
In questa fase dello sviluppo, il midollo spinale è chiaramente visibile e pertanto non sono necessarie tecniche di contrasto. Il midollo spinale è chiuso sia all'estremità cranica che caudale. Tuttavia, praticando fori con microcapillari nel tubo neurale e penetrando con un angolo leggermente obliquo, una microcapillare sufficientemente sottile e del diametro corretto dovrebbe penetrare nel tubo senza danneggiarlo.
Iniettare il DNA utilizzando una pipetta a bocca. Una microcapillare del diametro corretto dovrebbe rilasciare il DNA con un'espirazione regolare. Il colorante verde dovrebbe diffondersi dalla punta della coda fino alle vescicole del cervello in via di sviluppo.
Iniettare fino a quando il tubo neurale non sarà riempito con il DNA. L'elettroporazione è necessaria affinché il DNA iniettato entri nelle cellule. Posizionare prima gli elettrodi in parallelo rispetto al tubo neurale e il più vicino possibile a esso, senza toccare direttamente il tubo. Assicurarsi che gli elettrodi siano ricoperti di liquido per permettere la conduzione elettrica durante l'impulso.
Di solito, la soluzione di Hank aggiunta immediatamente dopo l'esposizione dell'embrione è sufficiente. Tuttavia, se necessario, aggiungere una goccia di soluzione di Hank poco prima dell'impulso, con gli elettrodi posizionati e immersi nel liquido, quindi applicare l'impulso elettroporativo. Successivamente, rimuovere con attenzione gli elettrodi e sigillare la finestra e l'uovo con del nastro adesivo. È importante sigillare completamente l'uovo per prevenire l'essiccamento dell'embrione durante il successivo periodo di incubazione.
Rimettere l'uovo nell'incubatrice e proseguire l'incubazione fino a quando l'embrione del pulcino raggiunge il sesto giorno embrionale di sviluppo, o E6, momento in cui è possibile procedere con l'acquisizione delle immagini. Quando l'embrione elettroporato ha raggiunto il sesto giorno embrionale di sviluppo, E6, tre giorni dopo l'elettroporazione, rimuoverlo dall'uovo e trasferirlo in una piastra di Petri rivestita di silicone contenente PBS, utilizzando forbici fini.
Rimuovere le membrane e distendere l'embrione sul suo lato ventrale utilizzando perni inseriti nella silicone per mantenerlo in posizione. Utilizzando una microcapillare affilata al tungsteno, effettuare un'incisione longitudinale lungo la lamina tettoica, dal cervelletto fino alla coda.
Eseguire due ulteriori incisioni longitudinali su entrambi i lati del midollo spinale, staccando i gangli delle radici dorsali o DRG dal midollo spinale. Staccare la lamina del pavimento dal tessuto partendo dalla coda fino al romboencefalo, lasciando il midollo spinale intatto. Infine, utilizzare forbici fini per tagliare trasversalmente il midollo spinale a livello del romboencefalo e separare il midollo spinale dal corpo.
Ora che il midollo spinale è stato isolato, distenderlo in una nuova piastra di Petri rivestita di silicone contenente PBS, utilizzando dei perni per fissarlo dal cervello posteriore fino alla coda, ottenendo così una preparazione in montaggio piatto. Fissare il midollo spiniale con paraformaldeide al 4% in PBS per un'ora a temperatura ambiente, quindi procedere alla colorazione immunoistochimica seguendo la procedura descritta nel protocollo scritto allegato, per montare il midollo spinale aperto. Preparare il campione per l'acquisizione delle immagini.
Spalmare del grasso o silicone a forma di rettangolo su un vetrino e far cadere al suo interno del PBS. Utilizzare pinzette per posizionare il midollo spinale, distendendolo al centro del rettangolo, ed asportare il liquido circostante. Con una pipetta Pasteur, applicare una o due gocce di mezzo di montaggio sul midollo spinale e coprire con un coprioggetto.
Applicare pressione sul vetrino coprioggetto. Per evitare bolle d'aria. Conservare i vetrini al buio a quattro gradi Celsius.
Esaminare il midollo spinale utilizzando la microscopia confocale. Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi di rigetti assonali di interneuroni spinali di pollo in esperimenti di controllo in cui la RFP è espressa in tutti i neuroni mediante un elemento enhancer ubiquitario del CMV: la maggior parte dei neuroni e dei loro assoni risulta marcata. È impossibile decifrare il tragitto assonale di sottopopolazioni neuronali.
Tuttavia, applicando elementi miglioratori specifici, viene rivelato un preciso tragitto assonale di una sottopopolazione specifica di due neuroni in questo esempio. Abbiamo appena mostrato come eseguire un'elettroporazione del tubo neurale della guancia con un miglioratore neuronale specifico all'E tre e come preparare un midollo spinale in forma di libro aperto all'E sei. Quando si esegue questa procedura, è necessario ricordare di essere accurati e pazienti.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti. Buona fortuna.
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Panoramica
Questo video illustra una procedura per visualizzare i percorsi assonali di neuroni geneticamente definiti nel midollo spinale di embrione di pollo mediante elettroporazione in ovo. Il metodo consente ai ricercatori di studiare efficacemente le traiettorie assonali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Elettrofisiologia
Sfondo
- Comprendere i percorsi assonali è fondamentale per la ricerca in neuroscienze.
- L'elettroporazione in ovo è una tecnica utilizzata per introdurre geni reporter.
- Il midollo spinale dell'embrione di pollo costituisce un modello per lo studio dello sviluppo neuronale.
- Popolazioni neuronali geneticamente definite possono fornire informazioni su circuiti neurali specifici.
Scopo dello studio
- Per visualizzare i percorsi assonali nel midollo spinale embrionale.
- Per utilizzare l'elettroporazione in ovo per studi sull'espressione genica.
- Per migliorare la comprensione dello sviluppo neuronale e delle connettività neurali.
Metodi Utilizzati
- Trasferire uova di pollo fecondate in un incubatore umidificato.
- Mantenere l'incubazione a una temperatura compresa tra 37 e 38 gradi Celsius.
- Eseguire l'elettroporazione in ovo per introdurre geni reporter.
- Preparare preparati del midollo spinale in forma di libro aperto per la visualizzazione.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dei percorsi assonali nel midollo spinale.
- Dimostrazione dell'efficacia dell'elettroporazione in ovo.
- Informazioni dettagliate sulle traiettorie di popolazioni neuronali definite geneticamente.
- Stabilimento di un metodo affidabile per lo studio dello sviluppo neuronale.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienze.
- L'elettroporazione in ovo è efficace per il trasferimento genico in modelli embrionali.
- Comprendere i percorsi assonali può contribuire agli studi sulla formazione dei circuiti neurali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una visualizzazione precisa delle traiettorie assonali in popolazioni neuronali definite geneticamente, affrontando una sfida fondamentale nella validazione degli obiettivi, in cui l'etichettatura bilaterale oscura le proiezioni controlaterali rispetto a quelle ipsilaterali. Restringendo l'espressione del reporter a un solo lato del tubo neurale mediante elettroporazione unilaterale in ovo, i ricercatori riescono a ridurre i rischi meccanicistici delle ipotesi sui circuiti neuronali fin dalle fasi iniziali della scoperta. L'approccio favorisce una maggiore sicurezza predittiva nella selezione degli obiettivi chiarificando i modelli di connettività specifici per il percorso, rilevanti per i modelli di malattie neurosviluppati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando le proiezioni assonali di specifiche sottopopolazioni neuronali definite da reporter guidati da enhancer.
- Valore operativo: Fornisce un'etichettatura unilaterale per distinguere gli assoni che proiettano controlateralmente e ipsilateralmente, riducendo l'ambiguità nella mappatura dei circuiti.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico dei bersagli chiarificando se una popolazione neuronale attiva vie eccitatorie o inibitorie fondamentali per il meccanismo della malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantificabili sul percorso assonale come lettura fenotipica per lo screening di modulatori genetici o farmacologici della guida neuronale.
- Valore operativo: Produce preparati standardizzati e riproducibili in montaggio integrale, compatibili con l'analisi confocale ad alta risoluzione e con pipeline automatizzate di analisi.
- Valore di scalabilità: Utilizza il modello di embrione di pollo, adatto a essere scalato per testare in multiple condizioni l'attività di elementi potenziatori o l'efficienza dell'elettroporazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Mappa percorsi assonali rilevanti per la malattia in modelli di midollo spinale vertebrale, consentendo l'allineamento con biomarcatori umani dei disturbi neurosviluppali.
- Continuità meccanicistica: Collega la validazione del target a stadio di scoperta con la valutazione preclinica degli effetti del farmaco a livello di circuito sulla crescita o sul guidaggio assonale.
- Avanzamento basato sul rischio: Informa le decisioni di proseguimento o interruzione rivelando se un target modula specifici schemi di proiezione associati al recupero funzionale o alla patologia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla generazione di ipotesi sul bersaglio all'identificazione di composti promettenti, fornendo informazioni meccanicistiche che precedono lo sviluppo di saggi funzionali e supportano l'allineamento di biomarcatori traslazionali.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'espressione genica specifica degli enhancer nel definire sottopopolazioni neuronali e le loro traiettorie assonali.
- Screening: Permette sistemi biologici pronti per saggi, con espressione del reporter standardizzata e unilaterale, per valutare gli effetti di composti sulla guida dell'assone.
- Analisi: Fornisce letture spaziali quantitative dei modelli di proiezione assonale, facilitando il confronto tra diverse condizioni genetiche o trattamenti.
- Ricerca Translazionale: Si collega a studi preclinici stabilendo modelli di vie assonali pertinenti alle malattie per la correlazione con biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Costituisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di costrutti genetici, elementi enhancer o parametri di elettroporazione su diversi bersagli neuronali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi risolvendo la direzionalità delle proiezioni assonali, un fattore critico nella valutazione degli effetti farmacologici specifici per circuito.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione attraverso parametri definiti di elettroporazione (tensione, durata dell'impulso, numero) e gestione graduale degli embrioni.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce di obiettivi le cui vie assonali non sono allineate ai meccanismi terapeutici desiderati.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio identificando obiettivi che modulano specifici schemi di proiezione rilevanti per gli endpoint clinici nelle indicazioni neurosviluppativi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche embriologiche, inclusa la determinazione dello stadio embrionale, la microiniezione e l'ottimizzazione dei parametri di elettroporazione.
- È vincolato a strumentazioni come generatori di impulsi, micromanipolatori, elettrodi al tungsteno e microscopia confocale per l'acquisizione delle immagini.
- Necessita della standardizzazione della concentrazione del DNA, della selezione degli elementi enhancer e del posizionamento degli elettrodi tra diversi utilizzatori e laboratori per ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento nel trasferire il modello ad altri sistemi vertebrati o a tipi neuronali diversi dai neuroni intercalari spinali.
- I limiti pratici includono la sensibilità della vitalità embrionale alle condizioni di incubazione e la difficoltà tecnica di ottenere un'elettroporazione unilaterale uniforme senza danneggiare il tubo neurale.
