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L'obiettivo generale di questa procedura è modificare l'espressione genica nei neuroni del sistema nervoso centrale embrionale. Questo risultato si ottiene innanzitutto recuperando femmine gravide a tempo controllato e preparandole per l'intervento chirurgico. I corni uterini vengono quindi esposti praticando un'incisione addominale.

Dopo l'esposizione degli embrioni, il DNA viene iniettato nel ventricolo laterale, nel terzo ventricolo o nello spazio subretinico. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'applicare una corrente elettrica all'embrione attraverso la parete uterina, posizionando gli elettrodi a paletta in modo che il polo positivo sia orientato sulla sede preferita di trasfezione. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la proliferazione, la migrazione e la differenziazione dei progenitori neurali nel cervello in via di sviluppo e nella retina mediante microscopia a immunofluorescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la degenerazione di topi transgenici, è che è rapida, consente studi ad alto rendimento e ha un costo inferiore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neurale, come quali geni regolano i progenitori neurali, la proliferazione cellulare, la specificazione del destino cellulare, la differenziazione neuronale e la migrazione cellulare. Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi verso una migliore comprensione dei percorsi genetici che sottendono i difetti nello sviluppo del sistema nervoso centrale, molti dei quali provocano deficit cognitivi e disturbi comportamentali nell'uomo. Oltre alla sua utilità nello studio dello sviluppo del sistema nervoso centrale.

Questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi organici, come il sistema nervoso periferico in via di sviluppo, il cuore e la placenta. Può inoltre essere utilizzata per lo studio di modelli di malattia nei topi, così come in altri organismi modello quali il pollo e lo xip. In generale, l'ostacolo principale al successo per chi si approccia per la prima volta a questa tecnica è la sopravvivenza dell'embrione; è necessario prestare molta attenzione durante la manipolazione, l'iniezione e il trasferimento degli embrioni.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo avuto la necessità di un mezzo rapido per manipolare l'espressione genica nell'embrione, nel telencefalo e nella retina. Abbiamo sviluppato questa tecnica nel nostro laboratorio modificando il metodo inizialmente descritto da Sal, pubblicato sulla rivista Developmental Biology nel 2001. Abbiamo inoltre collaborato con un laboratorio pilota per applicare questo protocollo anche nello sviluppo del dilon.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di iniezione ed elettroporazione sono difficili da apprendere, in quanto richiedono una manipolazione molto accurata degli embrioni e a volte i siti di iniezione possono essere molto piccoli. Ad esempio, lo spazio subretinico. A dimostrare la procedura oggi sarà Rajiv, un ricercatore postdottorato del laboratorio di Sherman. Per iniziare, pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici. Successivamente, riempire le siringhe con soluzione salina e soluzione di Ringer lattato e posizionarle su un tappetino riscaldante per riscaldarle nell'area chirurgica.

Sterilizzare un tappetino riscaldante con etanolo al 70% e quindi coprirlo con una garza sterile senza pelucchi. Impostare il tappetino riscaldante a 37 gradi Celsius. Posizionare l'animale in una piccola camera anestetica e anestetizzarlo somministrando isoflurano al 5% con ossigeno a un litro al minuto attraverso un vaporizzatore.

Assicurarsi di raccogliere i fumi di isofluorano mediante un sistema di depurazione. Una volta che la respirazione dell'animale è profonda e regolare, rimuoverlo dalla camera. Utilizzare il pizzicamento delle dita dei piedi e il riflesso di battito delle palpebre.

Per garantire un’anestesia completa, posizionare l’animale anestetizzato in posizione prona e utilizzare un tubo del respiratore per somministrare il 2,25% di fluoruro durante l’intervento chirurgico. Iniettare buprenorfina alla concentrazione di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo per via sottocutanea alla nuca.

Continuare a monitorare la respirazione dell'animale e regolare il flusso di isoflurano se necessario. Quindi applicare del nastro adesivo sul torace dell'animale anestetizzato e verificare nuovamente la risposta di ritrazione pizzicando il piede posteriore con pinze ottuse. Utilizzando un bastoncino sterile con estremità di cotone, stendere uno strato spesso di crema de sull'addome, assicurandosi che il pelo sottostante sia completamente ricoperto.

Lasciare la crema in posa per circa tre minuti e verificare periodicamente la depilazione. Utilizzando un tampone sterile, inumidire un pad di garza sterile con acqua sterile e rimuovere i peli dall'addome. Successivamente, sterilizzare il sito dell'incisione con clorhexidina e ulteriore acqua.

Asciugare l'addome con garza sterile pulita. Ripetere questo passaggio utilizzando etanolo al 70% e garza di cotone sterilizzata fresca. Indossare l'abbigliamento chirurgico per prepararsi all'intervento e esporre i corni uterini.

Per prima cosa, individuare la linea alba come linea tenue sotto la cute lungo la linea mediana. Utilizzando pinze, tirare la cute lontano dalla parete addominale ed eseguire un piccolo taglio lineare dall'addome medio verso il basso con forbici per cute, usando pinze curve e forbici. Ripetere la procedura con il peritoneo. Afferrare il peritoneo con le pinze.

Allontanarsi e quindi praticare un'incisione appena sufficiente per far passare l'utero. Posizionare una garza sterile con una piccola fessura verticale sull'incisione e inumidirla con soluzione salina sterile tiepida. Successivamente, far scivolare la pinza nell'incisione e individuare l'utero, tenendo l'incisione aperta con la pinza.

Afferrare l'utero tra il primo e il secondo embrione visibile e tirare entrambi i lati dei corni uterini sulla garza. Contare il numero di embrioni, annotando eventuali riassorbimenti o embrioni con dimensioni ridotte. Per preparare il numero corretto di iniezioni di DNA, inumidire i corni uterini con soluzione salina e reinserire con attenzione un corno uterino nell'addome.

Per caricare gli aghi chirurgici, utilizzare una pipetta con punta arrotondata e un bocchino applicato per aspirare 10 microlitri di una soluzione di DNA priva di endotossine a tre milligrammi per millilitro, contenente il colorante verde metile, ed espellere il DNA all'interno di un ago chirurgico. Montare il primo ago riempito sul micromanipolatore.

Posizionarsi sull'attaccamento all'iniettore partendo dall'embrione più vicino all'ovaio. Utilizzare pinze circolari per ruotare delicatamente l'embrione all'interno della decidua in modo che risulti rivolto in avanti, consentendo iniezioni nella direzione dal ROS al cordone. Utilizzare una sorgente luminosa a fibra ottica per identificare la linea mediana del cervello embrionale.

Osservare i grandi ventricoli laterali laterali nelle regioni rostrali. Tenere fermo l'embrione utilizzando pinze curve e posizionare l'ago chirurgico riempito sopra l'utero in modo che l'angolo di ingresso nel cervello sia di circa 45 gradi. Con un movimento rapido e costante, ruotare la manopola del micromanipolatore per inserire la punta dell'ago attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale del cervello embrionale.

Successivamente, premere la pedana del microiniettore. Per iniettare la soluzione di DNA, un'iniezione riuscita è facilmente visibile grazie alla diffusione del colorante verde metile all'interno dei ventricoli cerebrali dell'embrione. Ora che il DNA è stato iniettato, ritirare lentamente l'ago per rimuoverlo senza causare rotture.

Posizionare l'embrione iniettato sulla garza sterile e inumidirlo abbondantemente con soluzione fisiologica tiepida. Afferrare l'utero con il polo positivo dell'elettrodo a paletta posizionato sulla sede desiderata per la trasfezione. Quindi somministrare cinque impulsi elettrici quadrati di 40-50 volt e 50 millisecondi ciascuno, a un ritmo di un impulso al secondo.

Coprire l'embrione iniettato ed elettroporato con una garza umida protettiva, quindi procedere con l'iniezione del successivo embrione. Al termine dell'iniezione e dell'elettroporazione di tutti gli embrioni desiderati nel corno uterino, spingere con attenzione quest'ultimo all'interno della cavità corporea. Rimuovere il secondo corno uterino per iniziare l'iniezione e l'elettroporazione dei restanti embrioni.

Una volta che tutti gli embrioni sono stati reinseriti nell'utero, aggiungere due o tre millilitri di soluzione salina calda nella cavità addominale, quindi rimuovere la garza dall'addome per esporre i lati del peritoneo. Utilizzare filo di seta nero intrecciato per suturare il peritoneo, fissando il filo al peritoneo più vicino allo sterno e procedendo con i punti in direzione opposta all'ancoraggio. Assicurarsi che tutte le suture siano ben strette e che nessun organo sottostante o la cute vengano cuciti nel peritoneo.

Tagliare il filo residuo e scartarlo. Chiudere la pelle sulla linea di sutura con le pinze utilizzando punti metallici per la chiusura cutanea. Applicare i punti metallici sulla pelle avendo cura di non fissare accidentalmente la linea di sutura sottostante o di tendere eccessivamente la pelle.

Una volta terminato, assicurarsi che le puntine siano ben strette premendo delicatamente con lo strumento per suture in questo punto, A-P-C-I-G. Un vettore di espressione che guida l'espressione di GFP è stato elettroporato nella neocorteccia in via di sviluppo al giorno E 12. Mentre lo sviluppo della neocorteccia prosegue, i progenitori apicali si differenziano in progenitori basali secondari o in neuroni post-mitotici ed esprimono continuamente GFP. Queste cellule neurali possono quindi essere analizzate per l'espressione di marcatori tipici del sottotipo neuronale mostrati in rosso.

In questa vista ventrale di un proencefalo di embrione elettroporato a E12 e dissezionato a E14, il sito di elettroporazione è indicato dalla fluorescenza epifluorescente verde visibile a E14. L'espressione di GFP è osservabile nel talamo, pre-talamo e ipotalamo, indicando che i territori di interesse sono stati correttamente trasfettati. Il riquadro tratteggiato indica la posizione della sezione attraverso una zona ventricolare.

Un'analisi più approfondita della zona ventricolare mostra la migrazione delle cellule GFP al di fuori della zona ventricolare e verso la zona della guaina. Dove si formeranno i nuclei ipotalamici, anche la retina embrionale può essere facilmente elettroporata, come mostrato in questa sezione coronale di un embrione E16.5 elettroporato con PCIC all'E15.5. Qui, l'accumulo di cellule positive per mCherry è specifico dello strato neuroblastico esterno e non si osserva nelle cellule del ganglio retinico positive per Brrn3B nello strato delle cellule gangliari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti, qualora non insorgano complicazioni impreviste.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è fondamentale utilizzare adeguate tecniche sterili, una mano ferma durante la manipolazione degli embrioni e avere tutti i materiali necessari pronti prima di sottoporre la femmina incinta ad anestesia. Dopo questa procedura, gli embrioni elettroporati possono essere lasciati sviluppare fino all'età adulta, momento in cui altri metodi come test comportamentali e saggi funzionali possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardanti come la manipolazione di specifici geni nell'embrione influisca sulla funzione neuronale nell'adulto. Da quando è stata sviluppata, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo del sistema nervoso centrale per esplorare la funzione genica in vivo nel topo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come introdurre DNA estraneo nel tubo neurale embrionale. In particolare, ti mostriamo come preparare una femmina gravida per un intervento chirurgico, esporre l'utero, iniettare il DNA ed eseguire l'elettroporazione sull'embrione.

Ricordare che lavorare con l'isofluorano può essere pericoloso, e che precauzioni come l'utilizzo di un sistema di depurazione dovrebbero essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.