Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l'aria in fase di registrazione Electroolfactogram
2 marzo 2010
L'(EOG) è una registrazione electroolfactogram informativo, facile da condurre, e affidabile di valutazione della funzione olfattiva a livello dell'epitelio olfattivo. Questo protocollo descrive una configurazione di registrazione, di preparazione dei tessuti del mouse, raccolta dati e analisi dei dati di base.
Un preparato di epitelio olfattivo viene montato su una piastra e posizionato in un flusso di aria umidificata. Sotto un microscopio stereoscopico, un elettrodo di riferimento viene collegato elettricamente al tessuto attraverso una soluzione tampone. Un elettrodo di registrazione viene posizionato sulla superficie dell'epitelio olfattivo.
L'epitelio olfattivo viene stimolato da puff di odoranti controllati dal computer, somministrati in un flusso di aria umidificata, che trasporta gli odoranti all'epitelio olfattivo. I segnali EOG vengono trasmessi attraverso un amplificatore e un convertitore analogico-digitale al computer di registrazione. Ciao, sono Catherine Ciar del Laboratorio di Igiene XO del Dipartimento di Biologia della Johns Hopkins University.
Oggi vi mostreremo una procedura per registrare l'elettroolfattogramma nei topi. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le risposte dei neuroni sensoriali olfattivi agli odori. Cominciamo dunque.
L'apparato di registrazione è composto da un elettrodo di registrazione, un elettrodo di riferimento, un tubo di erogazione dell'aria, un portapreparati e un microscopio stereoscopico, tutti fissati su un tavolo antivibrazioni all'interno di una gabbia di Faraday. Manipolatori micrometrici vengono utilizzati per posizionare gli elettrodi all'interno del tubo di erogazione dell'aria. Un flusso d'aria continuo viene fatto passare attraverso acqua distillata per aggiungere umidità, prima di attraversare il tubo di erogazione e passare sopra il campione.
Una piastra di coltura da 60 millimetri riempita con sard adattato a sei-otto millimetri viene utilizzata come superficie di montaggio per il campione. Nella sard presente nella piastra di montaggio vengono ricavate una camera e un canale. Questi elementi permettono di collegare elettricamente l'elettrodo di riferimento al campione tramite una soluzione di Ringer modificata.
Gli elettrodi di registrazione e di riferimento sono collegati a un amplificatore. I segnali provenienti dall'amplificatore vengono inviati a un convertitore analogico-digitale e successivamente a un computer. Il software XI Graph viene utilizzato per controllare il protocollo di stimolazione, registrare il segnale e analizzare le risposte.
Un oscilloscopio è collegato dopo l'amplificatore per il monitoraggio in tempo reale del potenziale elettrico durante il posizionamento dell'elettrodo di registrazione e durante le registrazioni EOG. La somministrazione degli stimoli odorosi è controllata da uno spruzzatore a impulsi, che è collegato allo stesso computer utilizzato per l'acquisizione del segnale subito prima della somministrazione di uno stimolo odoroso.
L'uscita del pico spritzer è collegata a una bottiglia contenente un odorante liquido. La bottiglia è quindi collegata al tubo di somministrazione dell'aria. Vediamo ora come preparare gli elettrodi per gli esperimenti di registrazione.
L'elettrodo di registrazione è un filo d'argento clorurato inserito in una micropipetta di vetro riempita con soluzione di Ringer modificata. L'elettrodo di riferimento è un filo d'argento clorurato. Iniziare la preparazione di entrambi gli elettrodi inserendo un filo d'argento nel portaelettrodo.
Per l'elettrodo di registrazione, uno o due centimetri di filo devono sporgere dall'estremità del supporto dell'elettrodo. Per l'elettrodo di riferimento si può lasciare una lunghezza maggiore di filo. Per applicare il rivestimento di cloruro d'argento, posizionare il filo in cloruro di sodio 0,1 molare e collegare il supporto dell'elettrodo al terminale positivo di una fonte di alimentazione in corrente continua compresa tra 1,5 e 9 volt.
Il terminale negativo della fonte di alimentazione deve essere collegato elettricamente alla soluzione di cloruro di sodio 0,1 molare. Lasciare che la reazione del cloruro prosegua per 10 minuti per equalizzare qualsiasi carica statica tra l'elettrodo di registrazione e quello di riferimento. Toccare brevemente gli elettrodi tra loro prima di installarli sull'apparato di registrazione.
Successivamente, tirare una capillare di vetro utilizzando un estrattore per micropipette. L'apertura alla punta della capillare dovrebbe avere un diametro compreso tra cinque e dieci micron. Utilizzare una matita di diamante per incidere e rompere l'estremità smussata della capillare in modo che sia circa due centimetri più lunga del filo d'argento.
Utilizzare una fiamma di torcia al butano per lucidare a fuoco l'estremità tagliata e sciogliere ora l'agros allo 0,5% in soluzione di Ringer modificata. Utilizzare una pipetta di trasferimento per aspirare una piccola quantità di soluzione di agros fusa nella punta dell'elettrodo mediante una siringa che è stata riscaldata e tirata in modo da avere un'estremità lunga e sottile. Riempire il capillare tirato per circa metà della sua lunghezza.
Con la soluzione di Ringer modificata, battere leggermente sul capillare per rimuovere eventuali bolle d'aria. Conservare il microelettrodo riempito nel contenitore di conservazione con una piccola quantità di soluzione di Ringer modificata sul fondo, fino al momento dell'uso. Una volta preparato e pronto per la registrazione, posizionare un capillare riempito sul filo dell'elettrodo di registrazione, con gli elettrodi pronti all'uso.
Analizziamo un esperimento di registrazione per iniziare la preparazione del tessuto per la registrazione. Rimuovere la pelle sovrastante il cranio di un topo sacrificato e praticare un'incisione longitudinale lungo la linea mediana; montare una metà della testa con il lato mediale rivolto verso l'alto nella bacinella di montaggio. Rimuovere con attenzione il setto per esporre i turbinati.
Posizionare la piastra con il tessuto montato sulla platina di registrazione. Allineare la platina in modo che la posizione di registrazione sui turbinati sia centrata sotto il microscopio. Accendere ora la bombola dell'aria per erogare aria umidificata a circa 600 millilitri al minuto sulla superficie del turbinato.
Posizionare il tubo di erogazione dell'aria in modo che si trovi a circa 10 millimetri dal punto di registrazione. Impostare l'amplificatore in modalità DC poiché l'amplificazione in alternata indurrebbe artefatti nel segnale EOG. Acquisire con un filtro passa-basso di un chilohertz e un guadagno di 100 x.
Ora montare gli elettrodi di registrazione e di riferimento sui micromanipolatori. Abbassare l'elettrodo di riferimento nel pozzetto della piastra e coprirlo con soluzione di Ringer modificata in modo che sia elettricamente connesso al tessuto. Abbassare con attenzione l'elettrodo di registrazione sulla superficie della conca nasale due B o tre.
L'elettrodo dovrebbe toccare appena la superficie dell'epitelio olfattivo. Quando l'elettrodo entra in contatto con l'epitelio, una linea di base retta apparirà sull'oscilloscopio. A questo punto, collegare una bottiglia di odorante al port laterale del tubo di somministrazione dell'aria sul computer.
Avviare un protocollo di stimolazione. La frequenza di campionamento per l'acquisizione dei dati deve essere di due kilohertz o superiore. Il software attiverà un impulso di odore e inizierà la registrazione.
Un protocollo di stimolazione tipico può prevedere un singolo impulso di durata pari a 100 millisecondi, oppure impulsi accoppiati di 100 millisecondi separati da un intervallo di un secondo, oppure un impulso prolungato di dieci secondi. Per minimizzare l'adattamento, attendere da uno a cinque minuti tra un protocollo e l'altro dopo l'erogazione di concentrazioni elevate di odore. Eventuali residui odorosi possono permanere nel tubo; lavare il tubo dell'aria con etanolo al 95% e asciugare prima di proseguire con ulteriori campioni di tessuto.
Il software Axo graft fornisce strumenti per misurare parametri chiave del segnale EOG. Tali parametri includono l'ampiezza della risposta, la latenza, il tempo per raggiungere il picco e le costanti di tempo della terminazione. Diversi parametri dell'EOG sono particolarmente utili per il confronto tra risposte normalizzate nei topi, tra cui l'ampiezza della risposta, il tempo di salita della latenza, il tempo per raggiungere il picco e la costante di tempo della terminazione.
Qui sono mostrati i potenziali di campo olfattivo (OG) di un topo in risposta a stimolazioni con concentrazioni crescenti di acetato di amile liquido. La linea nera in alto indica i tempi e la durata della stimolazione odorosa. In questo caso osserviamo una relazione dose-risposta media ottenuta da cinque topi; le barre di errore rappresentano intervalli di confidenza al 95%.
Un calo dell'ampiezza del picco è spesso osservato a concentrazioni olfattive molto elevate. Un esempio di EOG in risposta a una stimolazione con impulsi accoppiati è mostrato: un singolo impulso breve di odorante induce un adattamento che dura diversi secondi. Qui è mostrato un EOG in risposta a 10 secondi di stimolazione olfattiva sostenuta.
L'EOG mostra una desensibilizzazione durante la presentazione continua dell'odorante. Vi abbiamo appena mostrato come registrare il grammo del fattore elettrodico da topi. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di posizionare l'elettrodo esattamente sulla superficie dell'epitelio e di non farlo penetrare al di sotto della superficie.
Registrare sempre dallo stesso lato della testa ed evitare modifiche all'allestimento per minimizzare le variazioni; mantenere il tessuto umido, ma senza accumulo di goccioline liquide. Posizionare il tessuto sotto aria umidificata immediatamente dopo la dissezione per conservarlo nelle migliori condizioni possibili per la registrazione. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo protocollo descrive la tecnica di registrazione dell'elettroolfattogramma (EOG), un metodo affidabile per valutare la funzione olfattiva a livello dell'epitelio olfattivo. La procedura comprende la preparazione del tessuto, l'acquisizione dei dati e l'analisi dati di base.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Funzione olfattiva
- Elettrofisiologia
Sfondo
- L'EOG è uno strumento prezioso per lo studio dei neuroni sensoriali olfattivi.
- Comporta la stimolazione dell'epitelio olfattivo mediante odoranti.
- Questa tecnica consente il monitoraggio in tempo reale delle risposte elettriche.
- Comprendere la funzione olfattiva è fondamentale per numerose applicazioni biologiche e mediche.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo per la registrazione dell'EOG dall'epitelio olfattivo del topo.
- Analizzare le risposte dei neuroni sensoriali olfattivi a diversi odoranti.
- Fornire un protocollo affidabile per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dell'epitelio olfattivo e configurazione dell'elettrodo.
- Utilizzo di un microscopio stereoscopico per il posizionamento dell'elettrodo.
- Stimolazione dell'epitelio con puff di odoranti controllati dal computer.
- Acquisizione dei dati tramite un amplificatore e un convertitore analogico-digitale.
Risultati principali
- Registrazione riuscita dei segnali EOG dall'epitelio olfattivo.
- Dimostrazione dell'affidabilità e facilità d'uso della procedura.
- Analisi delle risposte neuronali a diversi odoranti.
- Stabilimento di un protocollo per future ricerche olfattive.
Conclusioni
- Il metodo di registrazione dell'EOG è efficace per lo studio della funzione olfattiva.
- Questo protocollo può essere utilizzato dai ricercatori per esplorare le risposte dei neuroni sensoriali olfattivi.
- Studi futuri possono basarsi su questa tecnica fondamentale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La registrazione dell'elettroolfattogramma (EOG) in fase aerea consente una valutazione quantitativa della funzione dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) in modelli murini geneticamente modificati, supportando la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nelle neuroscienze sensoriali. Questo metodo fornisce letture quantitative e riproducibili delle risposte degli OSN alla stimolazione odorosa, facilitando il confronto incrociato tra manipolazioni genetiche e farmacologiche. La sua affidabilità e standardizzazione lo rendono uno strumento prezioso per la selezione di portafogli e la ricerca traslazionale in biologia olfattiva.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi diretta delle vie di trasduzione olfattiva in topi geneticamente modificati.
- Consente la validazione funzionale di geni candidati e componenti della segnalazione nelle cellule nervose olfattive (OSN).
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica quantificando l'ampiezza della risposta, la latenza e l'adattamento.
- Facilita una previsione affidabile nell'associare target molecolari a fenotipi sensoriali.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un saggio standardizzato e riproducibile per la valutazione della funzione dei neuroni sensoriali olfattivi in diverse condizioni sperimentali.
- Produce output quantitativi (ampiezza, cinetica) adatti per analisi comparative.
- Consente lo screening di interventi genetici o farmacologici che influenzano il segnale olfattivo.
- Permette la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per diversi pannelli di odoranti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia riguardo al disfunzionamento sensoriale e allo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla scoperta molecolare alla validazione preclinica dei fenotipi olfattivi.
- Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio per terapie mirate ai sensi.
- Offre una riduzione del rischio predittiva per la ricerca traslazionale nei disturbi olfattivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di registrazione EOG si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, collegando la manipolazione genetica, la validazione funzionale e la valutazione traslazionale dei bersagli olfattivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi di segnalazione nei neuroni sensoriali olfattivi.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre parametri di ampiezza, latenza e adattamento per confronti statistici robusti.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento con modelli di malattia e strategie di biomarcatori nelle neuroscienze sensoriali.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per studi genetici e farmacologici continui nell'olfatto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle OSN.
- Valore operativo: Standardizza l'acquisizione e l'analisi dei dati per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli di target sensoriali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di programmi di ricerca olfattiva corretta per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in elettrofisiologia e preparazione dei tessuti murini.
- Necessita di strumentazione specializzata, inclusi amplificatori, convertitori analogico-digitali e sistemi controllati per la somministrazione di odoranti.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per quanto riguarda il posizionamento degli elettrodi e i protocolli di stimolazione.
- L'adattamento a diversi background genetici o a diversi pannelli di odoranti potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- Il mantenimento della vitalità del tessuto e la riduzione al minimo dell'adattamento sono fondamentali per un'acquisizione dati affidabile.
