Le attività di imaging Odore-Evocati nel bulbo olfattivo del mouse utilizzando riflettanza ottica e segnali autofluorescenza

L'obiettivo generale di questo esperimento è mappare le attività evocate dagli odori sulla superficie del bulbo olfattivo di topi utilizzando segnali ottici intrinseci e segnali di autofluorescenza della flavoproteina, o imaging FAS, dopo aver anestetizzato il topo ed esposto il cranio. L'osso sovrastante il bulbo olfattivo viene assottigliato. Viene realizzato un lembo osseo mediante la punta della lama del bisturi e quindi rimosso; successivamente viene realizzata una camera in cemento dentale che circonda la superficie esposta del bulbo olfattivo.

Viene riempito con aros e un vetrino coprioggetto viene posizionato sopra questo preparato. Le mappe olfattive vengono acquisite in modo sequenziale nello stesso topo utilizzando segnali ottici intrinseci e imaging FAS. L’imaging di altre attività evocate nel bulbo olfattivo del topo mediante segnali di riflettanza ottica e autofluorescenza può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo alla disposizione spaziale degli ordini nel bulbo olfattivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l’imaging con due desossi glucosio o la fMRI, consiste nella possibilità di registrare attività evocate dagli ordini con una risoluzione spaziale pari a un singolo globo olfattivo.

Generalmente, le persone nuove a questi metodi incontreranno difficoltà all'inizio del loro lavoro, poiché le abilità chirurgiche e strumentali richiedono tempo per essere acquisite. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per attirare l'attenzione sui passaggi cruciali delle procedure chirurgiche e di imaging. Pizzicare la zampa posteriore del mouse per verificare l'anestesia e rimuovere i peli dal cuoio capelluto utilizzando un rasoio elettrico.

Eliminare eventuali residui di peli dalla pelle utilizzando tamponi di garza sterile inumiditi con acqua distillata. Posizionare il topo nel telaio stereotassico in modo che il muso si trovi nello stesso piano della parte posteriore della testa. Per posizionare orizzontalmente il bulbo olfattivo, fissare saldamente le barre auricolari e nasali al fine di impedire movimenti.

Applicare un unguento oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione durante l'acquisizione delle immagini, quindi disinfettare l'area del cuoio capelluto con Betadine utilizzando forbici sterili. Praticare un'incisione nella parte posteriore della testa tra le orecchie, quindi tagliare su entrambi i lati verso la base dell'orecchio e in direzione anteroposteriore verso la fronte lungo le palpebre. Completare la rimozione del cuoio capelluto tagliando la pelle del muso.

Utilizzando la barra nasale come guida, posizionare l'animale sotto un microscopio stereoscopico e usare un bastoncino di cotone imbevuto di soluzione salina per staccare delicatamente il periostio sulla parte superiore del cranio. Usare una pinzetta per rimuovere i tessuti residui e raschiare la superficie del cranio con un bisturi per garantire una preparazione accurata, mantenendo l'area del bulbo olfattivo umida per tutta la durata dell'esperimento.

Posizionare un pezzo di gelatina assorbibile, sotto forma di spugna imbevuta di acqua distillata, sull'osso sovrastante il bulbo olfattivo situato tra gli occhi. Rimuovere la spugna di gelatina e iniziare a raschiare delicatamente l'osso con una lama da bisturi numero 10. Mantenere un angolo costante di 45 gradi tra la lama e l'osso, spostando la lama dalle palpebre verso il lato sagittale della zona del bulbo.

Avendo cura di non applicare pressione verticale sull'osso né di graffiare l'osso sopra il seno venoso durante il processo di assottigliamento. Fermarsi ogni cinque minuti e posizionare una spugna di gelatina idratata sull'osso per raffreddare il preparato. Tamponare il cranio con la spugna per rimuovere frammenti ossei e polvere, e pulire periodicamente la punta del bisturi per mantenerla pulita e affilata.

Continuare fino a quando non diventa visibile lo strato osseo spugnoso o il trabecolato. Quando la vascolarizzazione fine del bulbo olfattivo diventa visibile, interrompere il graffio dell'osso e utilizzare la punta di un bisturi numero 11 per tracciare un'area rettangolare che racchiuda il bulbo olfattivo. Mantenendo la finestra entro i limiti dei seni venosi, continuare a graffiare l'osso all'interno dell'area rettangolare.

Prestare particolare attenzione alla profondità della punta del bisturi per evitare di toccare la superficie della dura madre. Per valutare lo spessore dell'osso residuo, spingere delicatamente con la punta di una pinzetta. Se l'osso si piega sotto pressione, passare al passaggio successivo.

Aggiungere una goccia di soluzione salina ed utilizzare la punta del bisturi orientata orizzontalmente per sollevare il lembo osseo. Rimuovere con attenzione il lembo utilizzando pinze, evitando di strappare l'osso residuo. Una volta esposta la superficie del bulbo olfattivo, verificare l'assenza di sanguinamento o vasi sanguigni. Anastomosi.

Pulire la zona con una spugna di gelatina imbevuta di soluzione salina. Per mantenere umido il bulbo olfattivo, applicare del cemento dentale in poli acrilato usando una siringa da 29 gauge per formare una camera sull'osso intorno alla finestra cranica. Applicare una goccia di paraffina a basso punto di fusione sulla dura madre e posizionare un vetrino sterile sopra la finestra cranica per l'acquisizione delle immagini.

Posizionare il telaio stereotassico sotto il microscopio stereoscopico con la finestra cranica centrata nel campo visivo focalizzato per mettere in evidenza i capillari. Passare alla luce verde di 580 nanometri ed acquisire un'immagine anatomica di controllo per verificare lo stato del preparato durante l'acquisizione. Procedere quindi con l'acquisizione delle prove di stimolazione utilizzando l'imaging del segnale ottico intrinseco con illuminazione a 630 nanometri oppure l'imaging del segnale autofluorescente della flavoproteina con illuminazione a 480 nanometri. Una sessione standard di acquisizione comprende un periodo di baseline di cinque-dieci secondi in cui viene somministrata soltanto aria, seguito dalla stimolazione odorosa per tre-dieci secondi a seconda della concentrazione odorosa scelta.

E infine, vengono registrati da 70 a 82 secondi di somministrazione di aria per il recupero della linea di base. In questo caso, la vascolatura del bulbo olfattivo viene immaginata attraverso la finestra cranica, seguita dai risultati di una prova di stimolazione utilizzando h sinal come odorante, acquisiti mediante imaging iOS e FAS. Attraverso l'imaging iOS, l'attività evocata dall'odore è mostrata come aree scure di assorbanza; le aree attivate dal AL sono indicate dalle frecce bianche, e le regioni attive possono essere osservate sia in singole prove che in prove multiple mediate.

Passando all'immagine FAS nello stesso topo, l'attività evocata nella OD è ora mostrata come aree bianche di emissione di autofluorescenza indicata dalle frecce nere, ed è osservabile sia nei singoli tracciati che nelle medie di più ripetizioni. Si noti che sia le zone nere di assorbimento osservate con l'immagine iOS sia le aree bianche di emissine di autofluorescenza osservate con l'immagine FAS si sovrappongono. Questa corrispondenza spaziale conferma che le due tecniche permettono la visualizzazione degli stessi glomeruli olfattivi. Una volta stabilito l'ordine di acquisizione delle immagini, le attività evocate possono essere registrate in un'ora per l'intervento chirurgico e alcune ore per l'acquisizione delle immagini.

I principali svantaggi nell'utilizzo di questi metodi di imaging ottico sono il fatto che non possono essere applicati per visualizzare mappe olfattive in topi liberi di muoversi. E a causa della limitata penetrazione dei fotoni nei tessuti biologici, non permettono di accedere ai glomeruli olfattivi ventrali dopo il loro sviluppo avvenuto alla fine degli anni '90, registrando segnali intrinseci nel sistema olfattivo. Forse un modo per i ricercatori nel campo dell'imaging ottico è esplorare le caratteristiche del particolare rivestimento degli odori.

Nell'immagine di autofluorescenza delle proteine flaviniche del bulbo olfattivo è una tecnica promettente per ottenere nuove informazioni sulla rivestimento speciale della OD mediante segnali ottici endogeni.