Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.
24 giugno 2010
Riportiamo lo sviluppo di un sistema automatizzato per l'imaging e l'analisi di zebrafish embrioni transgenici in piastre a pozzetti multipli. Questo dimostra la capacità di misurare gli effetti dose-dipendente di una piccola molecola, BCI, sull'espressione del gene del fattore di crescita dei fibroblasti giornalista e fornire tecnologia per stabilire high-throughput schermi chimici zebrafish.
In questo video viene eseguita una schermata ad alto contenuto basata su immagini per valutare la modulazione mediata da piccole molecole della via di segnalazione della chinasi della mappa del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti in embrioni di pesce zebra. Pesci zebra transgenici maschi e femmine selvatiche vengono accoppiati in una gabbia di riproduzione. Le uova fecondate cadono sul fondo e vengono raccolte e trasferite in una piastra di Petri. Gli embrioni vengono incubati durante la notte, quindi posizionati in pozzetti singoli di una piastra rotonda a 96 pozzetti.
Viene aggiunta la molecola di piccole dimensioni BCI per iperattivare la segnalazione FGF e la piastra viene incubata per sei ore. Le immagini di ogni pozzetto vengono acquisite mediante un lettore di piastre confocale e analizzate utilizzando un algoritmo progettato autonomamente, che riporta le intensità fluorescenti in specifiche strutture embrionali. Ciao, sono Hiba Kado del laboratorio del Dott. Michael Chang del Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare dell'Università di Pittsburgh.
Ciao, sono Andrea Spock dell'Istituto per la Scoperta di Farmaci dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostreremo la procedura per l'allevamento, la selezione e il posizionamento in piastra di embrioni di pesce zebra per il trattamento chimico. In una piastra a 96 pozzetti, utilizzeremo embrioni transgenici che segnalano l'attività del fattore di crescita del fibroblasto e li tratteremo con una molecola che iperattiva questa via.
Vi mostreremo come utilizziamo la metodologia di screening ad alto contenuto per acquisire, analizzare e quantificare automaticamente l'attività del fattore di crescita dei fibroblasti in embrioni di pesce zebra transgenici. Questa procedura metterà in evidenza la tecnologia di piattaforma per l'utilizzo di pesci zebra transgenici e schermate chimiche ad alto rendimento. Cominciamo dunque.
Due giorni prima del trattamento, identificare i pesci zebra transgenici maschi omozigoti e posizionarli in singoli acquari per l'accoppiamento. Aggiungere separatori nei contenitori, quindi aggiungere un pesce femmina di tipo selvatico in ciascun acquario e lasciare i pesci nelle gabbie di accoppiamento durante la notte a 28 gradi Celsius. La mattina seguente, rimuovere il separatore. Dopo un'ora, spostare i pesci in un nuovo contenitore e versare gli embrioni in un colino di plastica.
Trasferire gli embrioni in piastre da 100 millimetri con soluzione E3 e incubare a 28 gradi Celsius per sei-otto ore. Dopo l'incubazione, esaminare gli embrioni al microscopio stereoscopico. Gli embrioni adatti per gli esperimenti saranno in fase di gastrulazione.
In questo momento, rimuovere tutti gli embrioni non fecondati, che rimarranno allo stadio di singola cellula. Inoltre, rimuovere gli embrioni non vitali che appaiono opachi o malformati. Quindi aggiungere soluzione E tre fresca e incubare tutta la notte a 28 gradi Celsius.
Il giorno successivo, posizionare gli embrioni sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza per selezionare gli embrioni transgenici in stadio simile e con espressione uniforme di GFP. A 24 HPF, gli embrioni mostrano un evidente confine tra mesencefalo e romboencefalo, con intensa espressione di GFP e occhi ben formati con retine dorsali positive per GFP. Questi embrioni sono attivi e si muoveranno e contorceranno all'interno della coriona utilizzando una pipetta Pasteur di plastica.
Trasferire un embrione alla volta a 24 HPF in pozzetti singoli di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzando una micropipetta, rimuovere la soluzione E tre in eccesso dai pozzetti. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri di soluzione E tre in ogni pozzetto.
Successivamente, aggiungere due microlitri di DMSO in tutti i pozzetti delle colonne uno e 12. Quindi aggiungere due microlitri di BCL preparato in DMSO come segue: uno micromolare nelle colonne due e sette, cinque micromolari nelle colonne tre e otto, 10 micromolari nelle colonne quattro e nove, 20 micromolari.
Da micromolare a colonne cinque e dieci. E infine 25 micromolari alla colonna sei e undici. Ora coprire la piastra con pellicola di alluminio e incubare per sei ore a 28 gradi Celsius.
Aggiungere 10 microlitri di trica in ogni pozzetto per anestetizzare gli embrioni a 30 HPF. Successivamente, caricare la piastra nel software molecolare devices image express ultra open meta express. Scegliere una configurazione con un obiettivo Forex e il diametro massimo del diaframma a spillo.
Configurare l'autofocus laser per rilevare il fondo della piastra e utilizzare un offset Z ottimale predeterminato. Per rilevare le regioni di interesse, impostare l'area di scansione come un singolo sito di 2000 per 2000 pixel senza sovracampionamento. Selezionare il tipo di piastra appropriato e il laser all'argon a 488 nanometri con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente a 488 e 525 nanometri.
Quindi selezionare una pozzetta contenente un embrione trattato con il veicolo e fare clic su "trova campione". Lo strumento eseguirà una scansione di messa a fuoco automatica e acquisirà una singola immagine per confermare un corretto acquisizione. Selezionare casualmente una pozzetta trattata con il veicolo e acquisire un'immagine.
Se l'immagine è a fuoco e mostra l'espressione di GFP nella testa. Posizionare il cursore sulle aree più luminose e verificare che l'intensità della fluorescenza rientri nell'intervallo della telecamera a 16 bit. Inferiore a 65.000 unità.
Ripetere questi passaggi con un altro controllo veicolo e alcune pozzette trattate con il composto. Se necessario, regolare la potenza del laser e il guadagno in modo che le regioni più luminose nelle immagini del controllo positivo non siano saturate. Successivamente, nella finestra di acquisizione della piastra e di controllo, scegliere "acquisisci piastra" per avviare la scansione della piastra.
Lo strumento acquisirà automaticamente un'immagine per ogni pozzetto dell'intera micropiastra e le archivierà in un database SQL server. Al termine della scansione, caricare le immagini in D definition's Developer aprendo Developer con l'opzione slinger abilitata.
Crea un nuovo spazio di lavoro. Quindi, dal menu file, seleziona l'importazione personalizzata. Successivamente, vai alla cartella contenente le immagini e apri un file di esempio.
Scegliere un filtro di importazione che riconosca il formato delle immagini e la struttura dei file generati dalla piattaforma Molecular Devices ImageXpress Ultra. Per elaborare le immagini, aprire un'immagine di controllo e caricare la tecnologia della rete cognitiva desiderata, ovvero l'algoritmo CNT o un insieme di regole. L'algoritmo personalizzato utilizzato in questo caso è stato progettato per identificare automaticamente l'embrione, il tuorlo e la testa e per quantificare luminosità e area delle strutture della testa che esprimono GFP; eseguire quindi l'insieme di regole fino alla fase di rilevamento della testa e del tuorlo.
Per garantire un corretto riconoscimento del sacco vitellino e della testa, modificare l'insieme di regole per regolare la soglia di rilevamento del sacco vitellino qualora risulti troppo grande o troppo piccolo. Successivamente, eseguire l'insieme di regole fino alla fase di rilevamento delle strutture luminose della testa. Per assicurare un corretto riconoscimento delle aree esprimenti GFP nella testa, modificare l'insieme di regole per regolare la soglia di rilevamento delle strutture della testa in multipli dell'intensità media fino a quando il rilevamento delle strutture luminose della testa corrisponda all'osservazione visiva.
Successivamente, eseguire manualmente l'intero set di regole su diverse immagini scelte casualmente generate da embrioni trattati con veicolo e su immagini di controllo positivo provenienti da embrioni trattati con PCI. Per eseguire l'algoritmo su tutte le immagini della piastra, selezionare le piastre da analizzare e scegliere Analizza, quindi passare al set di regole ottimizzato e analizzare tutti i pozzetti.
Utilizzando il pianificatore di lavoro integrato, i pozzetti vuoti o le immagini ambigue verranno automaticamente esclusi dall'analisi durante la scansione. Viene mostrata una mappa di mantenimento in continuo aggiornamento. Sia i dati che le immagini sono accessibili durante l'esecuzione per un controllo visivo.
I dati numerici e le immagini elaborate vengono salvati automaticamente. Una volta analizzate tutte le immagini, i dati possono essere esportati in software di terze parti come Excel, GraphPad o Prism. Questa figura mostra immagini di scansione archiviate provenienti da una piastra trattata con veicolo e da una piastra trattata con BCI, con e senza analisi CNT.
La proteina verde fluorescente (GFP) applicata viene rilevata nell'occhio, al confine tra mesencefalo e romboencefalo e nei gangli trigeminali di embrioni transgenici. Si noti che sia l'intensità della GFP sia i domini di espressione risultano ampliati. Negli embrioni trattati con BCI, si osserva un effetto dose-dipendente del BCI sull'espressione del gene reporter GFP negli embrioni transgenici.
La concentrazione necessaria per ottenere una risposta massima al 50% o EC 50 era di circa 12 micromoli. Vi abbiamo appena mostrato come allevare, raccogliere e disporre embrioni di pesce zebra transgenico in piastre a 96 pozzetti. Abbiamo aggiunto concentrazioni crescenti di PCI nel proprio attivatore della via di segnalazione.
Abbiamo inoltre mostrato come automatizzare l'acquisizione di immagini di embrioni transgenici e abbiamo analizzato le immagini con un algoritmo appositamente progettato basato sulla tecnologia di rete cognitiva. Con questo approccio, siamo stati in grado di misurare in modo quantitativo e graduale gli effetti di un attivatore molecolare di piccole dimensioni della segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di scegliere con attenzione gli embrioni per minimizzare la variabilità tra i campioni.
È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
Panoramica
Questo studio presenta un sistema per l'acquisizione e l'analisi automatizzate di embrioni di pesce zebra transgenici in piastre multipozzetto. Illustra la capacità di misurare gli effetti dipendenti dalla dose della molecola di piccole dimensioni BCI sull'espressione del gene reporter del Fattore di Crescita dei Fibroblasti, facilitando schermate chimiche ad alto rendimento su pesce zebra.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Screening ad alto rendimento
Sfondo
- Il pesce zebra è comunemente utilizzato come organismo modello nella biologia dello sviluppo.
- I pesci zebra transgenici possono esprimere proteine fluorescenti, consentendo la visualizzazione dell'espressione genica.
- Il screening ad alto contenuto consente l'analisi simultanea di più campioni.
- La segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) è fondamentale per diversi processi dello sviluppo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema di imaging ad alto rendimento per embrioni di pesce zebra.
- Valutare gli effetti di piccole molecole sulla segnalazione FGF.
- Automatizzare l'analisi dell'espressione genica in pesci zebra transgenici.
Metodi Utilizzati
- Allevamento di zebrafish transgenici e raccolta di embrioni.
- Incubazione degli embrioni in piastre multipozzetto con concentrazioni variabili di BCI.
- Acquisizione automatica delle immagini mediante un lettore di piastre confocale.
- Analisi delle intensità fluorescenti mediante un algoritmo personalizzato.
Risultati principali
- Imaging e analisi riusciti di embrioni di pesce zebra in formato ad alta produttività.
- Effetti dose-dipendenti dimostrati del BCI sul segnale FGF.
- L'analisi automatizzata ha fornito una quantificazione affidabile dell'espressione genica.
- È stata stabilita una piattaforma per futuri screening chimici nel pesce zebra.
Conclusioni
- Il sistema sviluppato aumenta l'efficienza degli screening chimici nei zebrafish.
- Fornisce uno strumento utile per lo studio della segnalazione FGF nello sviluppo.
- Questa metodologia può essere applicata ad altre molecole piccole e vie di segnalazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi automatizzata mediante imaging degli embrioni di pesce zebra consente una valutazione scalabile e in vivo della modulazione delle vie di segnalazione, supportando la validazione precoce dei bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico nei processi di scoperta. L'approccio fornisce letture quantitative e dipendenti dalla dose che migliorano l'affidabilità predittiva degli effetti dei composti sull'attività della via FGF/RAS/MAPK. Ciò colloca il metodo come ponte traslazionale tra lo screening fenotipico e l'identificazione di composti promettenti nella ricerca e sviluppo del settore biotecnologico e farmaceutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la modulazione della segnalazione FGF in un sistema vertebrale rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico attraverso la quantificazione automatizzata dell'espressione del reporter GFP nelle strutture cefaliche embrionali.
- Valore predittivo: Genera dati di EC50 (circa 12 micromolare per BCI) per definire le relazioni struttura-attività e guidare la selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce letture standardizzate e riproducibili di intensità fluorescente da formati a piastre 96 pozzetti compatibili con flussi di lavoro ad alto rendimento.
- Scalabilità: Consente il posizionamento in matrice di embrioni transgenici a 24 hpf per il trattamento con composti e l'acquisizione automatica di immagini mediante lettori confocali HCS.
- Utilità dell'algoritmo: L'algoritmo personalizzato di Cognition Network Technology rileva e quantifica l'espressione di GFP in regioni embrionali definite, permettendo una valutazione affidabile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Utilizza embrioni di pesce zebra a 24-48 hpf, uno stadio di sviluppo con organi formati e trasparenza tissutale, che favorisce l'estrapolazione da in vivo a preclinico.
- De-risking meccanicistico: Misura risposte specifiche del percorso (attivazione del FGF) per distinguere gli effetti del composto sul bersaglio da quelli fuori bersaglio.
- Allineamento del biomarcatore: L'espressione del reporter GFP funge da biomarcatore traslazionale per la modulazione della via del FGF, rilevabile mediante analisi automatizzata delle immagini.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro delle fasi iniziali di scoperta, supportando la verifica delle ipotesi nella validazione del bersaglio e consentendo lo sviluppo di saggi scalabili per campagne di identificazione di composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Facilita la chiarificazione dei percorsi e la definizione della fiducia nel bersaglio attraverso l'analisi dose-risposta della modulazione della segnalazione FGF.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante acquisizione e analisi automatizzata delle immagini, assicurando riproducibilità tra diverse concentrazioni del composto.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (intensità e area della GFP) che permettono il confronto tra potenza ed efficacia dei composti.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica utilizzando embrioni di vertebrati con percorsi di segnalazione conservati e organogenesi visibile.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di molteplici piccole molecole e percorsi di segnalazione mediante reporter transgenici intercambiabili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella modulazione del bersaglio e riduce l'ambiguità meccanicistica nei test in fase iniziale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie all'acquisizione di immagini automatizzata e all'analisi basata su algoritmi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati quantitativi e dipendenti dalla dose sull'attività della via di segnalazione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei composti aggiustata in base al rischio, basata su parametri quali la CE50 e la risposta massimale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento di zebrafish, nella manipolazione di embrioni transgenici e nella microscopia a fluorescenza.
- È dipendente da strumentazione per screening ad alto contenuto confocale (ad esempio, Molecular Devices ImageXpress Ultra) e software per l'analisi delle immagini (Definiens Developer).
- Necessita di standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per lo stadio degli embrioni, la preparazione dei composti e i parametri di acquisizione delle immagini.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica l'algoritmo a diversi reporter transgenici o strutture embrionali.
- I limiti pratici includono la variabilità degli embrioni e la necessità di una selezione accurata dei campioni per ridurre al minimo il rumore, come indicato nel protocollo.
