Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

L'obiettivo generale del seguente esperimento è scoprire molecole di piccole dimensioni che modulino in modo specifico aspetti chiave dello sviluppo embriogenetico e della fisiologia. Questo risultato si ottiene posizionando un elevato numero di uova fecondate in piastre da screening a 96 pozzetti come secondo passaggio. Aliquote di una libreria di molecole di piccole dimensioni vengono quindi aggiunte alle piastre a 96 pozzetti contenenti gli embrioni.

Le piastre vengono esaminate per rilevare i fenotipi indotti dalle piccole molecole. Si ottengono risultati che mostrano quali piccole molecole influenzano specificamente lo sviluppo o la fisiologia del super pesce. Ciao, mi chiamo Charles Hong della School of Medicine della Vanderbilt University.

Nel nostro laboratorio, eseguiamo schermate chimiche ad alto rendimento utilizzando embrioni di pesce zebra. Questa è una tecnica relativamente semplice che può essere ampiamente adattata per scoprire nuovi composti bioattivi. Nel pomeriggio precedente il giorno della schermata chimica, preparare da 10 a 20 vasche di riproduzione per pesci zebra.

Inserire un divisorio in ciascun serbatoio e riempire ogni serbatoio con acqua dal sistema di acquacoltura utilizzando una rete da pesca, trasferendo un maschio adulto e una o due femmine adulte nel contenitore interno. In ciascun serbatoio di riproduzione, etichettare i serbatoi e coprirli con un coperchio la mattina dello screening. Rimuovere i divisorii dai serbatoi di riproduzione e permettere ai zebrafish di accoppiarsi.

Nel corso dell'ora successiva, lasciare che le uova fecondate cadano attraverso la griglia situata nella parte inferiore di ogni contenitore interno. Dopo un'ora, restituire gli adulti di pesce sebra ai serbatoi di stoccaggio permanenti.

Rimuovere il contenitore interno e raccogliere le uova filtrando l'acqua di ciascun serbatoio di allevamento attraverso un colino di plastica per tè. Capovolgere il colino su una piastra di Petri e risciacquare delicatamente il colino per far cadere le uova nella piastra. Utilizzando una bottiglia per lavaggio contenente mezzo E tre, rimuovere tutte le uova non fecondate, che appaiono opache.

Utilizzando una pipetta di plastica monouso, ogni incrocio dovrebbe produrre circa 200 embrioni. Successivamente, trasferire circa cinque embrioni in mezzo E tre in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta di vetro Pasteur. Una volta che gli embrioni sono stati disposti sulla piastra a 96 pozzetti.

Rimuovere con una pipetta a 12 canali la maggior quantità possibile di mezzo E three dalle pozzette, facendo attenzione a non perforare gli embrioni. Utilizzando la pipetta a 12 canali, aggiungere 250 microlitri di E three.

Aggiungere rapidamente a ciascun pozzetto del mezzo contenente 0,5 microgrammi per millilitro di canamicina, per evitare che gli embrioni si secchino. Posizionare le piastre a 96 pozzetti in un incubatore a 28,5 gradi Celsius fino a quando gli embrioni non raggiungono lo stadio desiderato, momento in cui verranno aggiunti i composti. In questo protocollo, si ricercano composti in grado di alterare il patterning embrionale precoce e gli embrioni verranno incubati per tre ore o fino a quando oltre il 90% degli embrioni non avrà raggiunto lo stadio della mille cellule, come tipicamente fornito dalle librerie di molecole di piccole dimensioni.

In una piastra sorgente a 96 pozzetti, con ciascun composto conservato in DMSO come soluzione madre da 10 millimolari, circa 60 minuti prima che gli embrioni raggiungano lo stadio desiderato scongelare un numero adeguato di piastre a 96 pozzetti contenenti aliquote di molecole di piccole dimensioni. Prendere nota del numero seriale o di altro codice identificativo delle piastre sorgente per ridurre al minimo la condensa sulle piastre. T cadere in una camera di essiccazione contenente essiccante.

Centrifugare brevemente le piastre in una centrifuga da banco dotata di adattatore per piastre multipozzetta. Rimuovere il nastro in alluminio dalla piastra sorgente utilizzando una pipetta a 12 canali e diluire i composti nella piastra sorgente alla concentrazione desiderata con DMSO. In questo protocollo, utilizziamo una concentrazione finale di 0,5 millimolare e aggiungiamo 4,75 microlitri di DMSO per diluire la piastra madre da 10 millimolare.

Quando gli embrioni nella piastra a 96 pozzetti raggiungono lo stadio desiderato, utilizzare una pipetta a 12 canali per trasferire 2,5 microlitri di composti dalle piastre sorgente alle piastre riceventi contenenti gli embrioni. Coprire le piastre contenenti ora gli embrioni e i composti con i coperchi e registrare il numero di identificazione delle piastre sorgente sulle piastre embrionali. Mescolare le piastre agitandole delicatamente e posizionarle in un incubatore a 28,5 °C.

Coprire ogni piastra sorgente contenente piccole molecole non utilizzate con pellicola di alluminio e sigillare con nastro adesivo, quindi collocare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Prima di eseguire lo screening visivo, definire un criterio specifico di risposta positiva. Ad esempio, in uno screening di inibitori a base di piccole molecole dello sviluppo del proencefalo, un risultato positivo può essere un composto che determina la perdita del proencefalo.

L'assenza di occhi è un indicatore visivo semplice della perdita del proencefalo e non richiede l'uso di fluorescenza per essere valutata nei tempi desiderati dello sviluppo. Rimuovere le piastre a 96 pozzetti contenenti embrioni trattati con il composto dall'incubatore ed esaminare ogni pozzetto al microscopio stereoscopico durante lo screening di inibitori a piccole molecole dello sviluppo del proencefalo; esaminare le piastre a 28 ore per verificare la perdita dell'occhio come marcatore di inibizione dello sviluppo del proencefalo. Registrare l'identità della piastra e la posizione del pozzetto per ciascun pozzetto in cui almeno tre embrioni su cinque mostrano il fenotipo hi prescritto. Riposizionare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore.

Riconfermare la perdita degli occhi e del proencefalo a 48 ore. Anche se gli embrioni non avranno un proencefalo, sopravvivranno almeno fino a quattro giorni. Riconfermare un potenziale risultato positivo ripetendo il test degli effetti del composto a diverse concentrazioni; per ciascuna concentrazione, si testano 10 embrioni in 0,5 millilitri di mezzo E3 in un formato di piastra a 48 pozzetti.

Il momento dell'aggiunta del composto per il retest deve essere identico a quello della schermata iniziale. Un HIIT viene confermato quando il fenotipo osservato si riproduce in maniera dose-dipendente durante il retest del composto. Infine, identificare il composto hi dal database di molecole piccole presente nella libreria chimica.

Utilizzando uno schermo chimico visivo basato sul pesce zebra, abbiamo scoperto un inibitore del segnale hedgehog a piccola molecola in base al suo effetto sull'asse corporeo. Questa immagine mostra embrioni esposti all'inibitore di hedgehog che presentano una marcata curvatura ventrale della coda. A 24 ore, gli stessi embrioni esaminati a 48 ore mostrano ancora il fenotipo con curvatura ventrale.

Questa immagine mostra l'embrione trattato con il composto in confronto all'embrione mutante della via di segnalazione hedgehog. Una volta acquisita padronanza di questa tecnica, una persona può analizzare circa 400 composti a settimana in sole poche ore. Questa tecnica ha inoltre aperto la strada ai biologi chimici nello studio di fenomeni come lo sviluppo cellulare, le vie di segnalazione cellulare e lo sviluppo embrionale.

Quando si lavora con piccole molecole non caratterizzate, è importante adottare adeguate misure di sicurezza, utilizzando camici da laboratorio e guanti, poiché queste molecole non caratterizzate potrebbero essere potenzialmente pericolose.