Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis
23 maggio 2010
Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare tecniche di imaging in tempo reale e metodi semplici di quantificazione per analizzare la morfologia delle cellule epiteliali embrionali. Questo viene raggiunto innanzitutto predisponendo tutti gli strumenti e l'apparecchiatura necessari. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'asportare l'esplan X da embrioni di rana e coltivarli in camere per una coltura a lungo termine.
Il terzo passaggio della procedura consiste nel raccogliere immagini ad alta risoluzione di cellule epiteliali in tempo reale. L'ultimo passaggio della procedura è quantificare i dettagli morfologici delle cellule epiteliali utilizzando ImageJ. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano le aree cellulari tracciate e le intensità della membrana mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Ciao, sono Sagar Joshi del Davidson Laboratory del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università di Pittsburgh.
Oggi vi mostreremo un procedimento per l'immagineggiatura di cellule vive e l'analisi quantitativa delle cellule epiteliali embrionali di Xenos lavia. Utilizziamo questo procedimento per studiare in tempo reale i cambiamenti del citoscheletro cellulare. Cominciamo dunque.
Per preparare le camere per la coltura di espansioni di blastoporo animali, utilizzare grasso siliconico per sigillare una camera acrilica su misura o una piccola rondella di nylon su un grande vetrino coprioggetto di 45 per 50 millimetri. Aggiungere un millilitro di BSA al 1% in un terzo di XMBS alla camera. Rivestire frammenti di vetrino coprioggetto con la stessa soluzione e incubare per due-quattro ore a temperatura ambiente oppure durante la notte a quattro gradi Celsius.
Per ridurre l'adesione dell'esplanato al vetro, risciacquare e riempire la camera con mezzo DFA fino a poco prima del trasferimento degli Xs, quindi risciacquare i frammenti di coprivetrino nello stesso modo. Successivamente, immergerli in una piastra contenente embrioni in coltura DFA che sono stati microiniettati allo stadio da una a quattro cellule con l'MR NA desiderato fino allo stadio desiderato in un terzo di XMBS. Utilizzare una pipetta di trasferimento con apertura inclinata per trasferire gli embrioni in una piastra contenente DFA sotto un microscopio stereoscopico da dissezione.
Utilizzare pinzette per isolare gli embrioni ed escindere una calotta animale. Utilizzare un anello di capello per sostenere un embrione in una posizione fissa. Utilizzare un coltello di capello per praticare un piccolo taglio al polo animale.
Eseguire ripetuti tagli lisci e rapidi per estendere l'incisione ed asportare l'ectoderma del cappuccio. Asportare in modo analogo tre o quattro x explant. Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per spostarli nella camera di coltura preparata.
Utilizzando l'anello di capello, posizionare ogni X explan in modo che l'epitelio sia rivolto verso il fondo della camera. Utilizzando pinzette, tenere un frammento di coprioggetto al suo centro.
Inumidire le estremità con grasso al silicone. Posizionare un frammento sopra ciascun X explan. Fissare leggermente ogni frammento in posizione con piccole quantità di grasso al silicone.
Avendo cura di non schiacciare eccessivamente l'esplan X. Riempire la camera con DFA e ricoprire i bordi superiori della camera con grasso al silicone. Quindi sigillare la parte superiore con un coprioggetto di 24 x 40 millimetri.
Regolare il livello del DFA all'interno della camera per ridurre le bolle d'aria e utilizzare un fazzoletto di carta per asciugare eventuali fuoriuscite. Le piante X possono ora essere coltivate a lungo termine nella camera sigillata per un giorno a temperatura ambiente; posizionare l'obiettivo 20x di un microscopio confocale. Posizionare la camera contenente l'espianto X sul portacampioni del microscopio e apporre piccoli pesi di bilanciamento sulla camera per mantenerla in posizione in campo chiaro.
Regolare la messa a fuoco e utilizzare il posizionamento grossolano per visualizzare le estremità apicali delle cellule superficiali. Passare alla fluorescenza e a un obiettivo con ingrandimento maggiore. Per acquisire singole immagini o filmati in time-lapse dell'epitelio espiantato, regolare l'acquisizione per ottenere l'immagine migliore possibile.
Fare riferimento alla parte scritta di questo protocollo per suggerimenti sull'ottimizzazione e sull'acquisizione di immagini. Mantenere la potenza del laser il più bassa possibile. Acquisire immagini o filmati in time-lapse dell'epitelio dell'esplanato x.
Consultare la parte scritta del protocollo per suggerimenti sulla raccolta dei dati. I file di immagini confocali possono essere analizzati in diversi modi. Di seguito sono riportati due esempi su come analizzare i file di dati utilizzando il software di analisi ImageJ con il plugin Bio-Formats.
Per misurare l'area cellulare di una cellula epiteliale, aprire il menu analizza e fare clic su imposta misure. Selezionare lo strumento di selezione dalla barra degli strumenti e delineare la cellula nel menu analizza, selezionare strumenti e quindi gestore ROI. Per aprire il gestore delle regioni di interesse, premere controllo t.
Per aggiungere il contorno al gestore delle ROI, selezionare e aggiungere tutti i contorni desiderati dall'immagine. Quindi fare clic su salva per memorizzare il set di ROI nel gestore delle ROI. Fare clic su misura.
La finestra dei risultati mostrerà ora le aree misurate di ogni ROI. Per misurare l'intensità di una membrana cellulare, selezionare lo strumento linea retta dalla barra degli strumenti di ImageJ. Tracciare una linea perpendicolare attraverso la membrana.
Premere CTRL T come nell'esempio precedente. Per aggiungere la selezione al gestore delle aree di interesse (ROI), aprire il menu analizza e fare clic su profilo del tracciato per generare un grafico delle intensità relative lungo la linea. Per salvare il grafico come immagine, fare clic su salva nella nuova finestra del grafico che appare.
Aprire il menu a discesa File, quindi selezionare Salva con nome. È stato appena mostrato come eseguire l'acquisizione in tempo reale e quantificare le cellule epiteliali embrionali da espianti animali CapEx. Durante questa procedura, è importante ricordare di aggiungere antibiotico e antibiotico al DFA. Per scoraggiare la crescita di batteri e funghi, prestare particolare attenzione durante la pressione degli espianti sotto le coprioggetti, poiché una pressione eccessiva potrebbe schiacciare l'espianto.
È inoltre importante ricordare di impostare correttamente il microscopio confocale per ottenere dati di immagine della massima qualità. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo illustra tecniche di imaging in vivo per lo studio della morfologia delle cellule epiteliali embrionali in Xenopus. Vengono evidenziati i metodi per l'isolamento dei tessuti di rana e la visualizzazione di cellule epiteliali vive mediante microscopia confocale.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- L'epitelio embrionale di Xenopus costituisce un modello per lo studio del comportamento cellulare.
- L'immagine in tempo reale di cellule vive integra la classica istologia.
- Comprendere la morfogenesi epiteliale è fondamentale per gli studi sullo sviluppo.
- La microscopia confocale consente la visualizzazione in tempo reale della dinamica cellulare.
Scopo dello studio
- Dimostrare tecniche di imaging in tempo reale per cellule epiteliali.
- Quantificare i dettagli morfologici delle cellule epiteliali.
- Fornire un protocollo per l'isolamento e la coltura di tessuti di rana.
Metodi Utilizzati
- Preparazione degli strumenti e dell'apparecchiatura per l'acquisizione di immagini.
- Escissione di tessuti da embrioni di rana per la coltura.
- Acquisizione di immagini ad alta risoluzione di cellule epiteliali.
- Quantificazione della morfologia cellulare mediante software Image J.
Risultati principali
- Sono state ottenute immagini ad alta risoluzione di cellule epiteliali vive.
- L'analisi quantitativa ha rivelato le aree cellulari tracciate e le intensità della membrana.
- L'immagine in tempo reale ha fornito informazioni sul comportamento cellulare durante la morfogenesi.
- I metodi sono stati convalidati per la coltura a lungo termine di tessuti di rana.
Conclusioni
- La microscopia confocale su cellule vive è efficace per lo studio delle cellule epiteliali.
- I metodi possono essere applicati a vari studi di biologia dello sviluppo.
- I risultati migliorano la comprensione della morfogenesi epiteliale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
L'analisi in tempo reale di cellule epiteliali embrionali in Xenopus laevis e l'analisi quantitativa forniscono una piattaforma dinamica per indagare i processi morfogenetici rilevanti per la scoperta precoce e la validazione di bersagli. La microscopia confocale ad alta risoluzione consente la misurazione in tempo reale della morfologia cellulare e del posizionamento delle proteine, sostenendo la robustezza predittiva dei modelli di biologia dello sviluppo. Questo flusso di lavoro aumenta il valore traslazionale dei sistemi epiteliali per la riduzione del rischio meccanicistica e la selezione di portafoglio nella ricerca preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'osservazione diretta in tempo reale dei cambiamenti del citoscheletro e della dinamica della forma cellulare.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli molecolari coinvolti nella morfogenesi epiteliale.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico quantificando le variazioni dell'area cellulare e dell'intensità della membrana.
- Fornisce una piattaforma per l'indagine guidata da ipotesi sui percorsi dello sviluppo.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi cellulari viventi validati per flussi di lavoro di imaging quantitativo successivi.
- Standardizza la misurazione di parametri morfologici mediante analisi riproducibile con ImageJ.
- Consente lo screening ad alto contenuto di composti che influenzano il comportamento delle cellule epiteliali.
- Supporta la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per studi comparativi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie catturando processi epiteliali dinamici.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie a output quantitativi.
- Riduce il rischio biologico fornendo letture cellulari predittive in tempo reale.
- Supporta l'identificazione di biomarcatori mediante imaging in tempo reale della localizzazione proteica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso della scoperta, dal test iniziale delle ipotesi alla validazione di modelli preclinici, sfruttando l'immagineggiamento di cellule vive per generare dati solidi.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi attraverso l'analisi morfologica in tempo reale.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni precise dell'area cellulare e dell'intensità della membrana per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega la ricerca di base e la ricerca preclinica supportando la modellizzazione di sistemi pertinenti alle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging e analisi riutilizzabile per diversi studi sugli epiteli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella biologia epiteliale.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità nei flussi di lavoro di imaging su cellule vive.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza del capitale fornendo dati quantitativi solidi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di asset nella fase di scoperta, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale e analisi quantitativa delle immagini.
- Necessita di accesso a strumentazione di imaging specializzata e a software di analisi (ad esempio, ImageJ).
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di imaging e delle misurazioni.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi sistemi modello o tipi di tessuto.
- Dipende da condizioni ottimali di coltura e da un'accurata manipolazione dei campioni per garantire la qualità dei dati.
