Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica

Per determinare la rigidità flessionale di singole cellule di coli, coltivare innanzitutto i batteri fino alla fase esponenziale, quindi attaccarli su una superficie di coprioggetto trattata chimicamente. Lasciare che le cellule già aderenti alla superficie continuino a crescere in modo da sviluppare estremità flessibili. Successivamente, introdurre flusso di microsfere dielettriche, intrappolare una microsfera e piegarla verso l'estremità flessibile di una cellula.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nel piegare la cellula con il trappolamento ottico e misurare i dati risultanti di spostamento forzato. La rigidità flessionale della cellula può essere calcolata mediante un'analisi di regressione lineare sui dati di spostamento forzato. Ciao, sono Steven Wong del laboratorio del Professor Joshua Shere presso l'Istituto Louis Sickler di Genomica Integrativa e il Dipartimento di Fisica dell'Università di Princeton.

Oggi vi mostreremo una procedura per piegare singole cellule batteriche e misurare la rigidità cellulare. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il contributo di diverse strutture intracellulari all'integrità meccanica delle cellule batteriche. Cominciamo dunque.

Per iniziare questa procedura, coltivare tre millilitri di cellule di e coli in mezzo LB fino alla fase esponenziale. Una volta che le cellule raggiungono una densità ottica a 600 nanometri compresa tra 0,2 e 0,4, aggiungere alla coltura 50 microgrammi per millilitro di cefalexina per 15 minuti per indurre la crescita filamentosa. Durante questi 15 minuti, preparare una camera di flusso.

Attacca due pezzi di nastro biadesivo con un intervallo di tre millimetri tra loro su un vetrino e fissa un'altro vetrino coprioggetto sulla parte superiore. L'intervallo tra i pezzi di nastro crea un canale per il flusso del liquido. Rivesti il vetrino coprioggetto con PEI facendo fluire 10 microlitri di polietilene al 1% diluito in acqua nella camera di flusso mediante una micropipetta e incuba per cinque minuti.

Quindi lavare facendo passare 200 microlitri di acqua in un'estremità della camera e raccogliendola all'altra estremità mediante vuoto. Dopo 15 minuti di crescita dei batteri in presenza di cefalexina, centrifugare un millilitro di cellule in una microcentrifuga e risospendere in 200 microlitri di LV con cefalexina. Successivamente, utilizzare nuovamente una micropipetta a un'estremità e il vuoto all'altra estremità per far fluire 50 microlitri della coltura cellulare concentrata nella camera contenente il coverslip rivestito e incubare per tre minuti.

Quindi lavare con 50 microlitri di Vel B integrato con cefalexina. Per rimuovere le cellule non aderenti, incubare la camera a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino a un'ora, in modo da permettere alle cellule aderenti di crescere, prima di posizionarle sullo strumento di optical trapping durante l'incubazione. Preparare le microsfere rivestite con polilisina incubando tre microlitri di microsfere di polistirene con diametro di 0,5 micrometri in una soluzione di polilisina 0,1% diluita in acqua per 30 minuti.

Una volta terminata l'incubazione delle perle, lavarle tre volte centrifugandole in una microcentrifuga e risospendendole in un millilitro di acqua; procedere quindi ad associare le perle ai batteri e misurare la rigidità di legame delle cellule. L'aspetto più difficile di questo protocollo consiste nel saper ricercare, localizzare e riconoscere una cellula adatta per le misurazioni della flessione e della rigidità. Una cellula adatta è quella con un'estremità ben definita fissata e un'estremità libera.

Esaminare al microscopio la camera a flusso per individuare una cellula con un'estremità ben fissata. Alcune cellule sono attaccate soltanto a un'estremità, e la forza flessionale all'altra estremità provoca una rotazione dell'intera cellula piuttosto che una flessione. Per trovare una cellula adatta, flettere rapidamente ciascuna cellula con il trappolamento ottico utilizzando il movimento dello stadio controllato dal joystick.

Quando si trova una cellula adatta, diluire la soluzione di perline di un fattore due in lb con cefalexina, aggiungere 30 microlitri della soluzione di perline alla camera di flusso pipettando in un'estremità ed estraendo delicatamente dall'altra estremità con un fazzoletto Kim per intrappolare otticamente una perla libera e toccare la punta libera di una cellula. Lavare nuovamente la camera mediante micropipetta e utilizzando un fazzoletto Kim bianco con 50 microlitri di cefalexina in LB per rimuovere le perline non attaccate. Successivamente, eseguire un programma personalizzato scritto in LabVIEW per applicare forze flessionali alla cellula e registrare i dati di spostamento forzato.

Per prima cosa, calibrare la risposta del rivelatore eseguendo una scansione RA della perla collegata all'interno del fascio laser di rilevamento e registrando i segnali di tensione PSD 3D. Successivamente, identificare l'asse maggiore della cellula in un'immagine al microscopio. Dopo aver identificato l'asse longitudinale della cellula, spostare la cellula a passi in una direzione perpendicolare all'asse maggiore, registrando contemporaneamente la distanza percorsa e lo spostamento della perla rispetto al centro del trappola ottica.

Infine, convertire i valori di spostamento in forza applicata utilizzando la rigidità della trappola precedentemente misurata e salvare. Lo spostamento della punta e la forza registrati in questo file rappresentano dati di forza-spostamento per una singola cellula. La pendenza di questa retta corrisponde alla rigidità flessionale della cellula.

Abbiamo appena mostrato come combinare la rigidità flessionale di E. coli con un trappola ottica. Quando si utilizza questo procedimento, è importante ricordarsi di trovare una buona cellula con un'estremità ben definita bloccata e un'estremità libera. È tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.