Registrazione Comportamento multicellulari in Myxococcus xanthus Biofilm utilizzando Time-lapse microcinematografia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un saggio di microcinematografia in time-lapse economico, ma sufficientemente rigoroso da produrre risultati riproducibili e quantificabili. Questo risultato si ottiene utilizzando guarnizioni di silicone riutilizzabili e poco costose per costruire piastre con terreni agarizzati o vetrini per microscopio. I risultati ottenuti dimostrano che questi complessi di piastre rimangono idratati e sufficientemente ossigenati per oltre una settimana, in diversi tipi di terreno e concentrazioni di agar.

Inoltre, poiché la microcinematografia in time-lapse è un processo lento, l'utilizzo di otto microscopi economici aiuta ad accelerare l'acquisizione dei dati. Ciao, sono Ryan Taylor del laboratorio del Dott. Roy Welch del Dipartimento di Biologia della Syracuse University. Oggi vi mostreremo una procedura per realizzare filmati in time-lapse di biofilm batterici nel nostro laboratorio; utilizzeremo questa procedura per studiare il comportamento multicellulare dei biofilm MTIs.

Cominciamo. Per iniziare questa procedura, misurare la densità cellulare di una coltura notturna di Occus sanus con un clutometro, trasferire un millilitro della coltura in un tubo da centrifuga da 2,5 millilitri, centrifugare, lavare e risospendere i batteri nel mezzo TPM come descritto nel protocollo scritto allegato, pipettare e vortexare per risospendere completamente il pellet, operazione che potrebbe richiedere del tempo. Successivamente, aggiungere 0,5 grammi di aros a 50 millilitri di TPM, che costituisce il mezzo per il saggio.

Aggiungere anche 0,5 grammi di aros a 50 millilitri di C-T-T-Y-E, che è il terreno di coltura in disco da sterilizzare in autoclave. Successivamente, mantenere il terreno a 55 gradi Celsius in un incubatore o bagno termico. Durante la preparazione del saggio di tracciamento.

I complessi della piastra procedono alla costruzione del disco nutriente prima della sterilizzazione a fiamma del vetrino microscopico in vetro. Posizionare sul vetrino una guarnizione sterile in gomma siliconica spessa 0,5 millimetri. Pipettare circa 300 microlitri di mezzo C TT YE aros nel pozzetto creato dalla guarnizione sul vetrino.

Il terreno solido C-T-T-Y-E deve essere riscaldato fino a incandescenza per sterilizzarlo; quindi sterilizzare un altro vetrino e appoggiarlo con un angolo rispetto al terreno solido C-T-T-Y-E. Posizionare il vetrino con un angolo evita la formazione di bolle. Una volta posizionato il vetrino, fissare l'insieme con due clip piccole, una per lato.

Posizionare il complesso tagliato a quattro gradi Celsius e lasciare solidificare l'agaro nel mezzo C-T-T-Y-E. Questo processo richiede solitamente circa cinque minuti. Una volta che l'agaro si è solidificato, è possibile preparare i complessi di piastre utilizzati nel saggio di tracciamento.

Iniziare preparando i vetrini per la costruzione dei complessi del saggio. Per ogni complesso, sterilizzare a fiamma due vetrini in vetro. Posizionare una guarnizione da autoclave su uno dei vetrini per formare la base del saggio.

L'altro vetrino viene utilizzato per appiattire gli agros e come vetrino di supporto. La parte superiore del saggio è costituita da un coprioggetto. Avvolgere innanzitutto un vetrino in nastro adesivo per etichette, quindi sterilizzare il coprioggetto di vetro alla fiamma e posizionarlo sopra il vetrino avvolto e sterilizzato.

Fare scorrere verso l'alto i supporti del vetrino avvolti per sostenere il coprioggetto, impedendo che si incrina. Posizionare una guarnizione per autoclave sopra il coprioggetto sterilizzato alla fiamma utilizzando pinzette. Premere verso il basso sulle guarnizioni del vetrino inferiore e sul coprioggetto per assicurarsi che formino una chiusura ermetica con il vetro.

In caso contrario, i mezzi di coltura potrebbero seccarsi. Mettere da parte la guarnizione del vetrino e le guarnizioni del coprioggetto con le superfici sterili rivolte verso l'alto e, da questo momento in poi, lavorare su un solo complesso alla volta per evitare che gli agarosio nei mezzi di coltura solidifichino, il che comprometterebbe la qualità del filmato. Iniziare posizionando il disco nutritivo.

Rimuovere il complesso del disco nutritivo da quattro gradi Celsius. Rimuovere l'eclissante e in precedenza separare i vetrini esponendo gli aros C-T-T-Y-E ormai solidificati utilizzando una pipetta micrometrica con una punta di vetro monouso da 100 microlitri. Prelevare un disco nutritivo di un millimetro di diametro dall'agar del mezzo C-T-T-Y-E e posizionarlo nella cavità creata dalla guarnizione sul vetrino coprioggetto.

Quindi prelevare l'agar del mezzo TPM dall'incubatrice e pipettare 300 microlitri nel pozzetto creato dalla guarnizione sul vetrino, contenente il disco nutritivo. L'agar del mezzo TPM deve formare una piccola elevazione, in modo da appiattire l'agar del mezzo T-P-M-S-A. Posizionare uno dei vetrini sterilizzati alla fiamma, privi di guarnizione, in posizione inclinata sopra l'agar del mezzo TPM. Disporre il vetrino in posizione inclinata aiuta a prevenire la formazione di bolle d'aria.

Stringere il complesso con graffette piccole, una su ciascun lato. Posizionare il complesso con le graffette a quattro gradi Celsius e lasciare solidificare il mezzo. Questo richiede solitamente circa cinque minuti.

Una volta che il mezzo si è solidificato, rimuovere il complesso da quattro gradi Celsius. Rimuovere le clip di fissaggio e premere l'estremità del complesso. Per allentare il vetrino avvolto nel nastro, rimuovere il vetrino avvolto nel nastro e posizionarlo sul banco per un uso successivo.

Quindi, utilizzando una pinzetta come cuneo, separare il complesso vetrino-coprioggetto-mezzo di tenuta agros dal vetrino di supporto e scartare il vetrino di supporto. Non utilizzare un movimento di leva per separare il complesso vetrino-coprioggetto-mezzo di tenuta, poiché ciò potrebbe causare la rottura del coprioggetto e/o l'adesione del mezzo di tenuta al vetrino di supporto.

Dopo aver rimosso il vetrino di supporto, posizionare il complesso del dispositivo con camera di scorrimento contenente il mezzo di coltura sul vetrino avvolto nel nastro adesivo, con la guarnizione rivolta verso l'alto. Posizionare questo complesso accanto a un becco Bunsen per consentire l'evaporazione di tutta l'umidità visibile dalla superficie appena esposta dell'agar del mezzo di coltura. Non lasciare asciugare l'agar del mezzo di coltura per più di un minuto.

Poiché ciò potrebbe influenzare il comportamento di nuvola di M Zant, procedere a piastrare le cellule sul complesso saggio appena preparato. Una volta che l'eccesso di umidità si è evaporato dal complesso di agarosio del tamponamento del vetrino, aspirare 0,5 microlitri delle cellule concentrate per depositarle sul mezzo. Aeros premere la punta della pipetta prima di avvicinarsi all'agarosio del mezzo.

Una goccia di cellule appare alla base della punta della pipetta, facilitando il rilascio delle cellule senza che la punta tocchi l'agarosio. Una depressione sulla superficie dell'agarosio può modificare il comportamento dello swarm. Abbassare verticalmente la pipetta per dispensare le cellule a circa un millimetro di distanza dal disco nutritivo incorporato.

Quindi estrarre la pipetta direttamente verso l'alto. In questo modo, si garantisce che lo strato batterico sia circolare. Una volta depositate le cellule, posizionare la piastra accanto al becco Bunsen per far asciugare il punto di inoculo per non più di 20 secondi.

Dopo l'essiccazione, allineare l'insieme del guarnizione del vetrino che forma la parte inferiore del complesso con la guarnizione sul coperchio. Inserire il mezzo della guarnizione sopra il complesso cellulare acro che forma la parte superiore del complesso. Premere delicatamente insieme per formare una chiusura ermetica.

Pulire le superfici del vetrino e del coprioggetto con un fazzoletto di carta kimwipe per rimuovere eventuali residui, al fine di prevenire la formazione di condensa. Posizionare il complesso sul portapreparati riscaldato del microscopio immediatamente dopo aver pulito i vetrini, con il vetrino rivolto verso il basso e il coprioggetto verso l'alto. Se si è formata della condensa, lasciare il complesso sul portapreparati riscaldato per alcuni secondi prima di avviare il software di acquisizione delle immagini.

Per preparare il filmato, selezionare l'obiettivo appropriato, 2x, 4x o 10x, sul microscopio. Accendere la telecamera e il microscopio e verificare i livelli di luce per assicurarsi che non sia troppo intensa. Avviare il computer e aprire il programma di acquisizione delle immagini.

Fare clic sulla finestra dell'immagine in tempo reale e mettere a fuoco il microscopio. L'immagine apparirà simile a quella mostrata qui. Iniziare ad acquisire le immagini.

Assicurarsi di controllare regolarmente il fuoco durante la prima ora, poiché l'agar del mezzo tende a depositarsi causando uno spostamento del fuoco. Al termine dell'acquisizione delle immagini, trasferire le immagini acquisite per l'archiviazione. Smontare il complesso del vetrino immergendolo in etanolo al 90% per tutta la notte oppure utilizzare TOLA per pulire le guarnizioni e riutilizzarle.

Questo filmato in time-lapse mostra em sottoposti al saggio di tracciamento descritto in questo articolo. La frequenza di acquisizione è di un'immagine al minuto con un ingrandimento di 20x; la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato in time-lapse mostra una popolazione di eant nelle cellule in cui l'1% delle cellule esprime GFP.

Il filmato è stato assemblato unendo immagini alternate a contrasto di fase e immagini fluorescenti. Il saggio è stato eseguito su C-T-T-Y-E con un tasso di acquisizione di 1 immagine al minuto a un ingrandimento di 100 x. Questo filmato in time-lapse mostra la motilità strisciante di M Anthes.

Questo saggio è stato eseguito su C-T-T-Y-E in Aros al 1%. La velocità di acquisizione è di un'immagine al minuto a un ingrandimento di 100 x. Questo filmato in TimeLapse mostra la motilità per contrazione di P OSA. Questo saggio è stato eseguito su LB in Aros al 1%. La velocità di acquisizione è di un'immagine al minuto.

Con un ingrandimento di 20x, la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato in time-lapse mostra la motilità collettiva di Smar. Il saggio è stato eseguito su LB e agar all'1%, con una frequenza di acquisizione di un'immagine al minuto.

Con un ingrandimento di 20x, la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato in time-lapse mostra la motilità scivolosa di EGT. Questo saggio è stato eseguito su LB con il 0,5% di Tag; la frequenza di acquisizione è di un'immagine al minuto, mentre con un ingrandimento di 20x la velocità di riproduzione è di 120 immagini al secondo a causa della fragilità del 0,5% di arose in lv.

In questo saggio si utilizzano le guarnizioni più grandi mostrate nella figura uno B. Abbiamo appena mostrato come generare filmati in time-lapse di biofilm batterici. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di procedere con calma e di essere il più preciso possibile per ottenere risultati costanti.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.