Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

Le spine dendritiche sono protrusioni della membrana del dendrite di un neurone che ricevono input sinaptici. L'allungamento, la riduzione, la comparsa o la scomparsa delle spine si verificano in risposta a cambiamenti nella funzione della rete neurale causati da specifici schemi di attività neurale. Questo fenomeno è noto come plasticità corticale per osservare i cambiamenti morfologici nelle spine dendritiche.

In animali vivi, una piastra per imaging viene fissata al cranio di un topo. Un'area del cranio viene assottigliata chirurgicamente e vengono acquisite immagini a bassa e alta ingrandimento. Le stesse aree vengono quindi reimagingate in successivi punti temporali.

I risultati ottenuti mostrano che la morfologia delle spine dendritiche può essere chiaramente visualizzata mediante una preparazione a cranio sottile in diversi punti temporali. Inoltre, la morfologia delle spine è altamente plastica, mostrando cambiamenti strutturali e anche la comparsa e la scomparsa di spine dendritiche. Ciao, sono Emily Kelly nel laboratorio di Anaya Maka del Dipartimento di Neurobiologia e Anatomia dell'Università di Rochester.

Oggi vi mostreremo la procedura per l'imaging cronico della corteccia vial del topo, successiva a una preparazione chiamata finestra. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il ricambio delle spine dendritiche. Cominciamo dunque.

Iniziare la procedura sterilizzando gli strumenti per un intervento chirurgico asettico. Successivamente, sterilizzare l'area di lavoro utilizzando etanolo al 70% e coprire la superficie operatoria con un campo sterile. Monitorare la profondità dell'anestesia in un topo anestetizzato con un cocktail di fentanil verificando la risposta a una leggera pressione sul dito del piede; il topo mostrato qui è un topo transgenico A-G-F-P-M in cui viene espressa la GFP.

Nelle cellule parametali dello strato cinque che proiettano processi dendritici negli strati superficiali. Per mantenere una temperatura corporea di 37,5 gradi Celsius, posizionare l'animale su una coperta riscaldante e monitorarlo con un termometro rettale collegato. Quindi applicare un unguento oftalmico agli occhi per evitarne l'essiccamento, utilizzando delle forbici.

Rimuovere i peli dalla parte posteriore della testa del topo, dalla zona dietro le orecchie fino agli occhi. Quindi pulire la sommità della testa dell'animale applicando prima il 70%ethanol, seguito da un'accurata detersione con Betadine e soluzione di Betadine. Eseguire un'incisione LCU dietro le orecchie e lungo il lato destro o sinistro della linea mediana, a seconda dell'emisfero da sottoporre a imaging fino agli occhi, quindi ripiegare la pelle lontano dal sito chirurgico.

Non rimuovere la cute poiché verrà suturata in seguito utilizzando pinzette fini. Sollevare delicatamente la cute verso l'alto e lontano dall'area di interesse. Utilizzando pinzette pulite, raschiare delicatamente il periostio dalla zona esposta del cranio.

Applicare una piccola quantità di cloruro ferrico al 10% sul cranio per asciugare completamente la membrana periostea ed assicurarsi che sia stata rimossa interamente. È importante che il cranio sia completamente asciutto. Per garantire un'adeguata adesione della colla, rimuovere delicatamente con una lama microchirurgica il periostio essiccato.

Successivamente, applicare uno strato sottile di colla acrilica Sano attorno alla finestra di imaging della piastra cranica in acciaio inossidabile e fissare la piastra al cranio. Con l'estremità di legno di un bastoncino di ovatta, applicare la colla lungo le giunzioni interne della finestra di imaging, assicurandosi di riempire tutti gli spazi tra la piastra di imaging e la curvatura del cranio. Aggiungere una goccia di acceleratore di colla all'interno della finestra.

Quindi rimuovere rapidamente l'eccesso. Lasciare asciugare la colla finché non sarà completamente secca. Utilizzando un trapano dentale dotato di una fresa in acciaio inossidabile da 0,7 millimetri, iniziare ad assottigliare il cranio nella finestra di imaging.

Alternare la perforazione con applicazioni occasionali di soluzione salina sterile allo 0,9% per evitare di generare troppo calore sul cranio. Assottigliare una finestra di quattro per quattro millimetri sul cranio utilizzando piccoli movimenti sulla superficie cranica.

Con il trapano dentale. Verificare lo spessore del cranio utilizzando pinze con estremità smussata. La superficie cranica si ammorbidirà leggermente applicando una pressione delicata.

Lo spessore ottimale del cranio per l'acquisizione di immagini è compreso tra 10 e 30 micron. Una volta assottigliato il cranio, pulire la finestra da tutti i detriti e applicare soluzione salina sul cranio. Fotografare la finestra di acquisizione con una fotocamera digitale montata su un microscopio stereoscopico.

La vascolarizzazione cerebrale in questa fotografia aiuterà a individuare la posizione in cui posizionare la piastra di imaging per le successive sessioni di acquisizione. Trasportare l'animale al microscopio a due fotoni. L'animale deve rimanere sulla coperta riscaldata e la temperatura corporea deve essere monitorata continuamente durante tutta la sessione di imaging.

Un microscopio a due fotoni con un laser mi tai. Si utilizza una pompa allo stato solido da 10 watt per una potenza massima e un'unità confocale Olympus Flow View modificata. Il sistema è ottimizzato per l'imaging di tessuti profondi e i rivelatori esterni sono installati il più vicino possibile all'obiettivo per consentire una massima rilevazione della fluorescenza proveniente dal cervello; aggiungere una goccia di soluzione salina sulla finestra di imaging utilizzando uno zoom digitale basso.

Individuare un'area contenente neuroni intensamente marcati utilizzando una fotocamera digitale fissata al microscopio. Successivamente, scattare una fotografia dell'area di imaging. Questo passaggio è necessario per tornare alla stessa posizione di imaging in un momento successivo.

Acquisire uno stack a basso ingrandimento attraverso tutta l'estensione visibile del cervello, mostrando l'estensione della ramificazione dendritica. Questo sarà utilizzato per localizzare l'area di imaging in successivi punti temporali, sia per i vasi sanguigni che per i dendriti. Mantenere la loro struttura in animali giovani e adulti mediante l'uso di software di imaging.

Aumentare l'ingrandimento digitale di otto volte, regolare le coordinate XY se necessario e acquisire uno stack ad alto ingrandimento, che mostrerà la morfologia dendritica dettagliata, inclusa la localizzazione e la struttura delle spine dendritiche. Prendere appunti dettagliati per ogni acquisizione dello stack, indicando le coordinate del campo, l'intervallo di acquisizione, l'incremento Z e il numero di passi nello stack. Questi appunti verranno utilizzati quando si tornerà a esaminare questo dendrite o assone in un momento successivo.

Dopo l'acquisizione delle immagini, rimuovere la piastra cranica staccandola delicatamente dalla superficie del cranio. Utilizzando pinzette, rimuovere eventuali residui di colla e pulire il cranio con soluzione fisiologica sterile allo 0,9%.

Chiudere la pelle sopra il cranio utilizzando un filo di sutura numero sei. Pulire l'area con etanolo al 70% al termine della procedura di imaging. Posizionare l'animale in una gabbia pulita sotto una lampada a calore fino a quando non si sveglia e recupera la mobilità.

Quindi restituire l'animale alla sua gabbia originale per eseguire nuovamente l'immagine a un tempo successivo, che può variare da due giorni a molti mesi dopo; rimuovere i punti e riaprire la pelle sulla testa. Utilizzando metodi asettici, usare l'immagine digitale della vascolarizzazione cerebrale ottenuta durante l'intervento chirurgico iniziale per localizzare la posizione originale di imaging. Quindi fissare nuovamente la piastra cranica come in precedenza.

Utilizzare una lama microchirurgica per rimuovere delicatamente qualsiasi osso che possa essersi rigenerato tra i diversi punti temporali di acquisizione, se necessario. Affinare con un trapano dentale, pulire la finestra di imaging dai detriti e applicare una goccia di soluzione salina sterile allo 0,9%. Trasportare l'animale a un microscopio a due fotoni e individuare l'area di imaging originale utilizzando l'immagine fluorescente digitale acquisita durante la sessione precedente.

Avviare il programma di visualizzazione del flusso. Aprire l'immagine originale a basso ingrandimento, fissare un foglio trasparente allo schermo del computer e disegnare il pattern principale dei vasi sanguigni utilizzando una penna per trasparenze. Successivamente, aprire l'immagine in tempo reale e riallineare la vascolarizzazione al pattern disegnato sul film trasparente.

Rimuovere la pellicola trasparente per riprendere le strutture ingrandite otto volte. Aprire la serie desiderata raccolta nella sessione di acquisizione precedente. Disegnare la struttura su un film di pellicola trasparente fissato allo schermo del computer.

Zoomare di otto volte rispetto all'immagine in tempo reale e allineare l'immagine con la trasparenza. A seconda della precisione con cui si allinea la posizione a basso ingrandimento, potrebbe essere necessario regolare leggermente anche l'angolo dell'immagine; impostare le coordinate di panoramica sui parametri di imaging del primo giorno, inclusi la dimensione del passo e il numero di immagini da acquisire. La reimaging di Zack può essere eseguita due volte. Il numero di volte in cui il cuoio capelluto viene aperto deve essere limitato per evitare di compromettere l'integrità del cranio, il che comporterebbe una scarsa risoluzione di imaging nei topi esprimenti GFP.

Un sottoinsieme di cellule parametali dello strato cinque e i corrispondenti processi dendritici sono stati visualizzati mediante microscopia a scansione laser a due fotoni in vivo; qui sono mostrati dendriti della corteccia visiva marcati con GFP. L'immagine è una proiezione di una singola immagine acquisita ogni cinque micron dalla PIA fino a una profondità finale di 175 micron. La regione delimitata dal riquadro è mostrata a ingrandimento maggiore qui al giorno zero e nuovamente al giorno quattro; a destra, ingrandimento maggiore di un'immagine di un ramo dendritico rispettivamente al giorno zero e al giorno quattro, confrontate.

Queste immagini mostrano spine stabili, indicate dalle punte di freccia bianche, spine ritratte perse, marcate dalla punta di freccia rossa, e nuove spine indicate dalla punta di freccia verde. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'immagine cronica a due fotoni nella corteccia visiva del mouse utilizzando una preparazione a cranio sottile. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di prestare particolare attenzione durante il processo di assottigliamento per evitare danni al cranio e alla dura madre sottostante, poiché ciò comporterebbe una scarsa risoluzione dell'immagine, e prendere appunti dettagliati.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.