Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l'imaging cerebrale cronica

Le tecniche di imaging stanno diventando sempre più importanti nello studio della funzione cerebrale. Tra queste, la microscopia laser a due fotoni si è affermata come un metodo estremamente utile perché consente lo studio del cervello di formica vivo e, con preparazioni adeguate, permette l'osservazione cronica della stessa area corticale per periodi che vanno da minuti a mesi.

In questo video, mostriamo una preparazione per l'immagine cronica in vivo del cervello mediante due microscopie foto. Il dottor Carl Voda, un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute presso Janelia Farm, ha inizialmente sviluppato la preparazione della finestra cranica che dimostreremo oggi. Ciao e Ricardo Must, dal laboratorio di Carlos Porter Cayo del Dipartimento di Neurologia dell'Università della California di Los Angeles.

Oggi vi mostreremo la procedura per creare una finestra cranica per l'immagine cronica in vivo. Questa preparazione è molto utile perché consente di ottenere immagini in profondità all'interno del cervello utilizzando un microscopio laser a due fotoni. Cominciamo dunque.

Prima di iniziare l'intervento chirurgico, i topi vengono anestetizzati con isoflurano: 4% per l'induzione, da uno punto cinque a 2% per l'intervento chirurgico, utilizzando procedure approvate dal comitato I-A-C-U-C. È importante utilizzare stimolazioni dolorose della coda e/o delle dita dei piedi per assicurarsi che l'animale sia completamente sedato. Utilizzando un rasoio per roditori, il pelo dalla nuca fino agli occhi viene rasato.

Dopo la rasatura, il topo viene posizionato su un telaio stereotassico, appoggiato su una coperta con circolazione d'acqua regolata a 37 gradi Celsius; la testa viene quindi fissata saldamente utilizzando barre auricolari. Viene poi applicato un unguento oculare per prevenire l'essiccamento degli occhi dell'animale. Successivamente, vengono somministrati per via sottocutanea desametasone, 0,2 milligrammi per chilogrammo, e carprofene, cinque milligrammi per chilogrammo.

Al fine di prevenire rispettivamente il rigonfiamento del cervello e una risposta infiammatoria. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi di sterilizzare l'area operatoria passando sulla pelle tre tamponi alternati di alcol al 70% e Betadine. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati precedentemente sterilizzati utilizzando un sterilizzatore a perle di vetro, con forbici che sono state spruzzate con etanolo.

La pelle sulla sommità del cranio viene rimossa, iniziando con un taglio orizzontale lungo la base della testa, seguito da due tagli in direzione rostrale, quasi fino alle palpebre. Successivamente, due tagli obliqui che convergono sulla linea mediana. A questo punto, una goccia di soluzione di lidocaina ed epinefrina viene applicata sul periostio per evitare sanguinamento eccessivo o dolore; con un bisturi il periostio viene quindi retratto ai margini del cranio.

La muscolatura della parte posteriore del collo viene anche leggermente retratta. L'intera area esposta del cranio viene quindi delicatamente raschiata con un bisturi per creare una superficie asciutta. Questo passaggio è molto importante perché permetterà una migliore adesione della colla quando verrà applicata in seguito.

Una volta scelto il sito di imaging, si è pronti per creare innanzitutto la finestra cranica. Un cerchio di circa quattro millimetri di diametro viene tracciato delicatamente con un trapano dentale pneumatico. Dopo una leggera fresatura, la soluzione di lidocaina con epinefrina viene nuovamente applicata sulla superficie del cranio.

La perforazione viene interrotta quando rimane uno strato molto sottile di osso, solitamente uno spessore pari a un naso. Questa fase si raggiunge spingendo delicatamente al centro della craniotomia per verificare quanto ceda sotto una goccia di soluzione salina, sfruttando la struttura trabecolare dell'osso. Una struttura ossea spugnosa.

La craniotomia viene sollevata dal cranio con pinzette a punta molto sottile. La soluzione salina è importante perché aiuta a sollevare il cranio e a prevenire il sanguinamento della dura madre. Successivamente, viene applicato sulla meninge un foglio di gelatina spugnosa precedentemente imbevuto di soluzione salina, al fine di arrestare eventuali piccoli sanguinamenti che talvolta si verificano durante la rimozione del cranio.

Dopo aver asciugato la superficie della dura madre e aver verificato l'assenza di sanguinamento, un vetrino sterile di cinque millimetri viene posizionato delicatamente sulla dura madre. Una goccia di colla a base di cianoacrilato viene applicata sull'emisfero opposto del cranio. Con l'aiuto di un ago, la colla viene distribuita delicatamente tutto intorno alla finestra, avendo cura di non inserirla sotto il vetrino.

Ora è possibile applicare una sottile strato di colla su tutta la superficie del cranio. Una volta che la colla si è asciugata, si prepara l'acrilico dentale e lo si applica su tutta la superficie del cranio, coprendo anche un piccolo bordo del vetrino per fissarlo. Dopo aver fissato il vetrino, si crea un piccolo pozzetto intorno alla finestra utilizzando l'acrilico dentale.

Una barra di titanio è inoltre incorporata nell'acrilico dentale. Questa barra verrà successivamente utilizzata per fissare il topo in modo sicuro sullo stadio del microscopio. Per l'acquisizione delle immagini, è fondamentale garantire che la barra sia in piano, in modo da risultare parallela alla finestra cranica.

Posizionare un pezzo di carta sotto la barretta può permettere alla barretta di rimanere in piano mentre l'acrilico si indurisce; l'acrilico dentale viene lasciato polimerizzare o indurire per 10 minuti, al termine dei quali la barretta in titanio è stata fissata stabilmente. L'animale viene quindi collocato in una gabbia riscaldata finché non si riprende. Dopo il risveglio dall'anestesia, l'animale può essere sottoposto a imaging nello stesso giorno.

Questo filmato mostra una serie di 160 immagini acquisite a intervalli di cinque micron mediante il nostro microscopio personalizzato a due fotoni attraverso una finestra cranica posizionata sopra la corteccia somatosensoriale di un topo GFPM di tre mesi. Questa linea transgenica di topi esprime GFP in un piccolo sottoinsieme di neuroni piramidali. Negli strati cinque e due-tre, l'immagine è stata acquisita con un obiettivo ad immersione in acqua 40x con apertura numerica di 0,8, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 910 nanometri.

Nelle immagini più superficiali, è facile riconoscere gli alberi dendritici dei dendriti apicali delle cellule parametali. Il ramo apicale dei dendriti di ciascun neurone converge in un singolo dendrite apicale di grandi dimensioni. Si possono osservare anche più piccoli dendriti obliqui che si diramano da questo dendrite apicale principale; sono inoltre evidenti assoni che attraversano il campo visivo.

Questa è una serie di 12 immagini acquisite ogni uno e mezzo micrometro utilizzando lo stesso obiettivo 40x ad ingrandimento maggiore, in cui viene mostrato un dendrite superficiale ad alta risoluzione, sufficiente a distinguere singoli spine dendritiche. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la preparazione di una finestra cranica per l’imaging cronico del cervello mediante microscopia foto. Questo è un metodo estremamente potente per lo studio del cervello, poiché consente di analizzare sia la struttura che la funzione del cervello in vivo, non soltanto in una singola sessione di imaging, ma anche in modo cronico attraverso molteplici sessioni di imaging nel corso di mesi.

Un altro vantaggio della preparazione della finestra cranica è che può essere immaginata un'ampia area di visione, il che permette di visualizzare strutture di grandi dimensioni come un intero assone o l'albero dendritico su estensioni di millimetri. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di lavorare nelle condizioni più pulite e sterili possibili e di avere una mano molto ferma. Ok, e questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.