Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica
4 ottobre 2010
Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.
Lo studio della risposta cellulare in tempo reale alla stimolazione meccanica viene effettuato coltivando prima le cellule che esprimono proteine di fusione GFP in piatti con fondo in vetro per 24 ore. Il secondo passaggio consiste nel rivestire la punta A FM con fibronectina biotinilata. Successivamente, la punta A FM funzionalizzata viene messa a contatto con la superficie cellulare per consentire la formazione di una forte adesione focale intorno alla punta A FM, permettendo una manipolazione diretta del citoscheletro di actina attraverso un legame matrice-integrina-actina tra la punta rivestita di fibronectina e la cellula.
L'ultimo passaggio consiste nel stimolare meccanicamente la cellula vivente mediante un movimento controllato verso l'alto della punta AFM, in modo che la forza verticale venga applicata nel punto di contatto con la cellula senza rompere l'adesione focale forte. Alla fine, i risultati mostrano che le cellule rispondono alla stimolazione meccanica rafforzando il loro attacco al substrato e inducendo il riorganizzazione del citoscheletro di actina, come registrato mediante imaging ottico fluorescente in tempo reale. Ciao, sono Andrea Trake, professore assistente del Dipartimento di Biologia dei Sistemi e Medicina Traslazionale presso il Texas A&M Health Science Center.
Ciao, sono Sum Lim. Sono ricercatore postdottorato presso il Dipartimento di Biologia dei Sistemi e Medicina Traslazionale del Texas A&M Health Science Center. Oggi vi mostreremo un procedimento per lo studio del rimodellamento cellulare adattativo in risposta a stimolazione meccanica.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare in tempo reale il rimodellamento del citoscheletro in cellule muscolari lisce vascolari vive. Cominciamo dunque. Per questi studi, si utilizza un microscopio invertito Olympus IX 81 dotato di un sistema di fluorescenza a riflessione totale interna, o TIRF, abbinato a una testa di scansione CSU 22 Yokogawa.
Un microscopio a forza atomica bio scope SZ è montato sulla parte superiore di un microscopio ottico invertito. L'intero sistema è posizionato su un tavolo ottico di ricerca e in precedenza è stato descritto in dettaglio. Questo microscopio integrato utilizza due telecamere quant EM a moltiplicazione elettronica a accoppiamento di carica, o E-M-C-C-D.
Uno è per l'acquisizione di immagini in campo e l'altro per l'acquisizione confocale. L'assiemaggio confocale, composto dallo scanner a disco rotante, dalla ruota portafiltri esterna e da una telecamera E-M-C-C-D, è montato su una piastra di base in alluminio posizionata sopra un tappetino di silicone necessario per l'isolamento dalle vibrazioni. L'intero assiemaggio confocale si collega al microscopio tramite una flangia con collare filettato.
Pertanto, l'assemblaggio può essere disaccoppiato dal microscopio durante la microscopia a forza atomica o misurazioni in modalità FM per evitare vibrazioni provenienti dallo scanner rotante. Un laser ad argon-krypton viene utilizzato come sorgente di eccitazione sia per l'imaging in modalità TIRF sia per quella confocale. Il laser può essere accoppiato a una delle due fibre ottiche, che trasportano la luce laser rispettivamente al modulo TIRF o alla testa di scansione confocale.
Due computer controllano il sistema. Uno utilizza un software di tipo slide book, che gestisce l'immagine ottica, e l'altro un software nano scope, che controlla l'AFM. Ventiquattro ore prima dell'esperimento di stimolazione meccanica, posizionare cellule vive che esprimono costrutti GFP diretti contro proteine specifiche in una piastra per colture cellulari con fondo in vetro. Nel giorno dell'esperimento, sostituire il mezzo di coltura cellulare con un mezzo privo di rosso fenolo.
Poiché un esperimento di FM è molto sensibile al rumore, evitare di parlare o toccare il tavolo ottico o il microscopio durante l'esperimento per minimizzare il rumore. Nelle misurazioni in FM, disaccoppiare il disco rotante confocale dal microscopio. L'esperimento inizia montando la piastra per colture cellulari sullo stadio FM con un collare magnetico per fissare la piastra allo stadio magnetico del microscopio.
La mensola a forma di V sulla sonda AFM è personalizzata con una microsfera di vetro biotinilata di due micron. La mensola può essere facilmente osservata utilizzando il microscopio. La sfera è incollata all'estremità della mensola, ed è proprio qui che la soluzione di rivestimento deve essere applicata goccia a goccia.
Per preparare una sonda FM per l'esperimento, montare innanzitutto la punta nel supporto di vetro, quindi posizionare il supporto di vetro sul supporto da tavolo per rivestire la punta. Lavare la punta lasciando cadere con attenzione 10 microlitri di soluzione salina fosfato docos o DPBS all'estremità della punta, quindi utilizzare un fazzoletto kim per asciugare la punta. Ripetere questa procedura cinque volte dopo il lavaggio con DPBS a un milligrammo per millilitro.
Aggiungere avido in soluzione. Aggiungere goccia a goccia sulla punta. Lasciare incubare la punta per cinque minuti dopo il rivestimento con avadon.
Lavare la punta altre cinque volte con DPBS. Quindi cross-linkare la fibronectina biotinilata sull'avadon aggiungendo una soluzione di un milligrammo per millilitro, goccia a goccia sulla punta e incubando per cinque minuti.
Infine, lavare nuovamente la punta cinque volte con DPBS, lasciando l'ultima goccia sulla punta. Una volta preparata la punta, montarla su uno scanner FM. Dopo aver montato la punta FM, posizionare una gonna protettiva in silicone intorno al supporto.
Quindi impostare il microscopio per la visione video. Successivamente, allineare una punta FM al centro del campo visivo. Regolare la leva ottica posizionando il fascio laser all'estremità della mensola.
Quindi passare all'obiettivo ad alto ingrandimento appropriato per l'immagine di singole cellule. Successivamente, portare la cellula, che verrà stimolata meccanicamente, nel campo visivo e scegliere un punto in cui la punta AFM dovrà appoggiarsi sulla superficie cellulare. Infine, abbassare la punta AFM fino a quando non tocca la specifica cellula.
Dopo aver portato la punta a contatto con la cellula, attendere circa 20 minuti. Ciò permette la formazione di una salda adesione focale nel punto di contatto del manipolatore magnetico sulla superficie della cellula. Trascorso il periodo di attesa, è possibile iniziare la procedura di stimolazione meccanica per preparare l'esperimento di stimolazione meccanica.
Passare dalla videocamera alla telecamera E-M-C-C-D per consentire la visualizzazione delle cellule fluorescenti durante l'acquisizione delle immagini. Successivamente, acquisire un'immagine iniziale della cellula a riposo. Utilizzare la microscopia a disco rotante e la microscopia vocale per la visualizzazione dell'actina nel citoscheletro in tutta la cellula.
Al contrario, utilizzare il turf per visualizzare le adesioni focali al fine di stimolare la cellula. Utilizzare il cantilever per applicare un movimento controllato verso l'alto in passaggi discreti ogni tre-cinque minuti. Durante l'acquisizione dei dati A FM, è importante che l'operatore monitori costantemente la tensione della posizione Z piso per determinare il momento appropriato per il polo verticale.
Contemporaneamente all'acquisizione dei dati FM, registrare un'immagine confocale o turf della cellula dopo ogni estrazione verticale utilizzando il software Slide Book. Infine, al termine dell'esperimento di stimolazione, ritirare la punta FM dalla cellula. Una cellula muscolare liscia vascolare trasfettata con actina MRFP e vcul.
La GFP è stata immaginata utilizzando un MF sulla superficie apicale della cellula. La stessa cellula è stata immaginata utilizzando turf sulla superficie basale della cellula. Qui le due immagini sono sovrapposte.
È stata acquisita anche un'immagine della stessa cellula mediante microscopia confocale a disco rotante in tutta l'area del corpo cellulare ed è mostrata come proiezione massima di uno stack 3D. Si osserva un buon sovrapposizione tra le immagini ottenute con AFM e quelle confocali a disco rotante. Questa cellula di muscolo liscio vascolare, transfettata con actina MRFP, è stata stimolata meccanicamente mediante AFM e immaginata mediante microscopia confocale a disco rotante.
Gli errori indicano fibre di actina che mostrano un notevole riassetto in seguito a una stimolazione FM. Alcune fibre di actina si polimerizzano mentre altre si depolimerizzano a causa della stimolazione meccanica; altre fibre di actina si raggruppano in fasci. A causa del riassetto dell'actina, abbiamo appena mostrato come stimolare meccanicamente una coltura cellulare vitale utilizzando l'EFM, registrando contemporaneamente il riassetto del citoscheletro mediante metodi di imaging ottico.
Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che un esperimento di FM è estremamente rumoroso e sensibile. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con le vostre affermazioni.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per l'utilizzo di un microscopio integrato a forza atomica e imaging ottico per stimolare meccanicamente cellule vive in coltura. La metodologia comprende una guida passo dopo passo e mostra dati rappresentativi sulle risposte delle cellule vive alla stimolazione meccanica.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Stimolazione meccanica
- Immagini di cellule vive
Sfondo
- Comprendere la risposta delle cellule agli stimoli meccanici è fondamentale nella biologia cellulare.
- La microscopia a forza atomica consente una manipolazione precisa delle cellule.
- L'immagine in tempo reale di cellule vive fornisce informazioni immediate sui processi cellulari.
- Le adesioni focali svolgono un ruolo chiave nell'adesione cellulare e nella risposta agli stimoli.
Scopo dello studio
- Spiegare il funzionamento di un microscopio specializzato per lo studio di cellule vive.
- Dimostrare gli effetti della stimolazione meccanica su cellule vive.
- Fornire un protocollo dettagliato affinché i ricercatori possano replicare lo studio.
Metodi Utilizzati
- Le cellule che esprimono proteine di fusione GFP vengono coltivate su piatti di vetro.
- La punta dell'AFM è ricoperta di fibronectina biotinilata.
- La punta dell'AFM funzionalizzata viene utilizzata per creare aderenze focali con la superficie cellulare.
- Una stimolazione meccanica viene applicata mediante un movimento controllato verso l'alto della punta dell'AFM.
Risultati principali
- Le cellule hanno rafforzato il loro attacco al substrato in seguito a stimolazione.
- È stata osservata una riorganizzazione del citoscheletro di actina in risposta a forze meccaniche.
- L'imaging fluorescente in tempo reale ha catturato le risposte cellulari dinamiche.
- Il protocollo ha dimostrato con successo l'efficacia della tecnica.
Conclusioni
- Il microscopio integrato studia efficacemente le risposte delle cellule vive a stimoli meccanici.
- Questo metodo può migliorare la comprensione della meccanica cellulare e dell'adesione.
- Applicazioni future potrebbero includere l'esplorazione di vari tipi cellulari e condizioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere come le cellule viventi percepiscono e si adattano alle forze meccaniche è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione dei bersagli nei percorsi di meccanotrasduzione. Questo approccio integrato di imaging AFM-ottico consente di risolvere in tempo reale e a livello subcellulare la dinamica del citoscheletro e delle adesioni, fornendo un'elevata affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando stimoli meccanici a riorganizzazioni strutturali. Il metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistico permettendo la visualizzazione diretta del rimodellamento dell'actina indotto dalle forze e del rafforzamento delle adesioni focali, guidando le decisioni di avanzamento o interruzione nella selezione preclinica dei bersagli.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche rivelando come la stimolazione meccanica innescchi il riorganizzarsi del citoscheletro di actina e il rafforzamento delle adesioni focali.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli attraverso l'osservazione diretta della dinamica citoscheletrica dipendente dalla forza in cellule aderenti vive.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio collegando input meccanici a output strutturali, riducendo l'ambiguità nell'interazione con bersagli meccanosensibili.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo protocolli riproducibili per la stimolazione meccanica e l'acquisizione in tempo reale.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione dei saggi e la produzione di dati quantitativi mediante un movimento controllato della punta del microscopio a forza atomica (AFM) e letture fluorescenti sincronizzate.
- Scalabilità: Mette in evidenza la riutilizzabilità della piattaforma su diversi tipi di cellule aderenti, consentendo una valutazione affidabile di composti in campagne di screening di meccanobiologia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Illustra la rilevanza per le malattie dimostrando il coupling strutturale apicale-basale, in cui la stimolazione apicale induce un riorganizzazione lungo tutto il corpo cellulare.
- Avanzamento Aggiustato per il Rischio: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica catturando le risposte dinamiche che informano l'allineamento dei biomarcatori nei percorsi di meccanotrasduzione.
- De-risking Meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo di de-risking mostrando come l'applicazione di forze porti alla polimerizzazione, depolimerizzazione e aggregazione dell'actina, chiarificando il meccanismo d'azione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel processo di scoperta, dall'analisi delle ipotesi fino all'identificazione del composto capostipite, fornendo informazioni meccanicistiche prima dello screening dei composti.
- Biologia della Scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi applicando una stimolazione meccanica controllata e osservando in tempo reale il rimodellamento del citoscheletro.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso la formazione riproducibile di adesioni focali e l’imaging quantitativo della dinamica dell’actina mediante modalità TIRF e confocale.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni come gli eventi di polimerizzazione/depolymerizzazione dell’actina e le variazioni di intensità delle adesioni focali, che permettono di confrontare stati stimolati e stati di riposo.
- Ricerca Translazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica mostrando come la stimolazione meccanica apicale propaghi cambiamenti strutturali attraverso il corpo cellulare, un aspetto rilevante per la trasmissione di forze a livello tissutale.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per lo studio di bersagli meccanosensibili in modelli cellulari vascolari, epiteliali e mesenchimali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei percorsi di meccanotrasduzione.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della stimolazione meccanica e dell'imaging multimodale.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi di meccanobiologia.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate sull'osservazione diretta dell'adattamento cellulare indotto da forze meccaniche.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza scientifica specifica nell'uso dell'AFM, nell'immagine di cellule vive e nella dinamica del citoscheletro.
- Le apparecchiature necessarie includono un sistema integrato AFM-TIRF-confocale con smorzamento delle vibrazioni e due telecamere EM-CCD.
- La standardizzazione tra gruppi di lavoro richiede l'aderenza al protocollo per la funzionalizzazione delle punte, la formazione delle adesioni focali e i tempi di stimolazione.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la variazione della rigidità del substrato, delle proteine di rivestimento e dei tipi cellulari, mantenendo al contempo la specificità della stimolazione apicale.
- I limiti pratici includono la sensibilità al rumore durante le misurazioni con AFM e la necessità di condizioni ambientali controllate per ridurre al minimo le deriva.
