Metastasi sperimentale e CTL adottivi Immunoterapia modello di trasferimento del mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare l'efficacia dell'immunoterapia mediante trasferimento adottivo di linfociti T specifici per il tumore in vivo. Questo viene innanzitutto ottenuto trapiantando cellule tumorali mediante iniezione nella vena caudale laterale nei topi, al fine di indurre metastasi polmonari. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trattare i topi portatori di tumore con linfociti T citotossici (CTL) specifici per il tumore.

L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare l'inchiostro di china come metodo per visualizzare e quantificare i noduli tumorali. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'efficacia comparativa dei diversi trattamenti misurando la dimensione del tumore e quantificando il numero di noduli tumorali. Salve, mi chiamo Mary Zimmerman e sono un membro del laboratorio del Dottor Kevin Lu presso la Medical College of Georgia.

Ciao, mi chiamo Shelene Hu. Sono uno studente del secondo anno e lavoro anche nel laboratorio del dottor Lou. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi tradizionali, come le curve di sopravvivenza, è che questa procedura è sia qualitativa che quantitativa. Le implicazioni delle tecniche possono estendersi alla terapia del cancro perché imita l'immunoterapia adottiva con linfociti T in pazienti umani affetti da cancro.

Iniziamo: il giorno prima delle iniezioni di cellule tumorali, seminare un flacone T 75 con fino a 1 × 10⁷ cellule CMS4-MET in 10 millilitri di mezzo RPMI contenente il 10% di siero. Per ottenere cellule tumorali in rapida crescita, incubare tutta la notte a 37 °C nel giorno dell'iniezione.

Rimuovere il mezzo e lavare le cellule una volta con PBS, quindi raccogliere le cellule tumorali con tripsina-EDTA 0,05% a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Arrestare la reazione con 10 millilitri di mezzo RPMI contenente siero al 10%. Trasferire le cellule in un tubo conico.

Centrifugare le cellule a 1300 g in una centrifuga val legend RT per tre minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il soprannatante, risospendere le cellule in 10 millilitri di HBSS fresco 1X per lavarle. Quindi centrifugare nuovamente e risospendere nello stesso modo.

Contare le cellule tumorali su un emo.citometro. Diluire le cellule in HBSS in modo che le cellule necessarie per ogni iniezione siano sospese. In un volume totale di 100 microlitri, riscaldare i topi B SEA di sei-otto settimane in un becher, immersi in acqua calda.

Per dilatare la vena della coda, posizionare il topo in un dispositivo di contenimento per la coda appoggiato sul bancone. Utilizzare una siringa micro per iniettare 100 microlitri di cellule tumorali nella vena laterale della coda. Adottare una tecnica asettica per evitare infezioni dopo l'iniezione.

Applicare una leggera pressione sul sito di iniezione fino a quando l'emorragia non si è arrestata. Restituire il topo alla gabbia e lasciare che il tumore cresca fino alla fase desiderata. Nel giorno del trasferimento, aspirare e dispensare più volte per risospendere i linfociti T citotossici purificati o CTL preparati.

Come descritto nel testo, trasferire tutte le cellule da una piastra in un tubo conico da 15 millilitri, senza far sì che il volume superi i due terzi del tubo. Inserire una pipetta di Pasteur sterile nel tubo conico e stratificare il mezzo di separazione dei linfociti o LSM sotto le cellule fino a quando il volume totale si avvicina a 14 millilitri.

Attenzione a non disturbare gli strati. Centrifugare a 2000 giri/min per 20 minuti a temperatura ambiente. Non utilizzare il freno per rallentare il rotore dopo la centrifugazione; trasferire i CTL in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.

Aggiungere HBSS fino a un volume di circa 10 millilitri. Lavare. Contare le cellule, centrifugare a 1300 giri al minuto per cinque minuti, quindi risospendere a temperatura ambiente in HBSS alla densità cellulare richiesta per le iniezioni.

Mantenendo il volume totale per iniezione a 100 microlitri. Utilizzare la stessa tecnica di iniezione nella coda mostrata in precedenza in questo video. Per iniettare i CTL nei topi portatori di tumore, reinserire il topo nella gabbia e permettere ai CTL di interagire con il tumore.

Di solito i topi vengono sacrificati per l'analisi da 14 a 21 giorni dopo il trattamento con CTL. Per visualizzare le metastasi polmonari, posizionare un topo sacrificato supino su una tavola di polistirolo. Fissare le zampe con dei perni per garantire un accesso ininterrotto alla trachea.

Spruzzare la faccia ventrale con etanolo al 70%, partendo dall'addome medio. Usare le forbici per effettuare un'incisione lungo la linea mediana attraverso la gabbia toracica e proseguire verso le ghiandole salivari. Esporre la trachea.

Utilizzare pinzette per rimuovere i tessuti circostanti la trachea. Far scivolare la punta di una pipetta da 200 microlitri sotto la trachea, tenendo la punta con una mano. Sollevare delicatamente la trachea verso l'alto e lontano dal corpo.

Ruotare la piattaforma di 180 gradi. Utilizzare una siringa da 50 millilitri per iniettare inchiostro di India nei polmoni attraverso la trachea. Riempire completamente i polmoni di inchiostro fino a quando non si avverte una forte resistenza.

Usare le forbici per tagliare la trachea. Far scivolare una pinza sotto i polmoni e sollevarli fuori dal topo. Sciacquare brevemente i polmoni in un becher da un litro contenente acqua all'interno di una cappa chimica.

Trasferire i polmoni in un contenitore di vetro contenente cinque millilitri di soluzione FTI. Il tessuto tumorale emergerà come noduli bianchi sui polmoni scuri. Dopo alcuni minuti, i tumori possono ora essere contati e conservati indefinitamente nella soluzione FTI. Qui.

Polmoni di topi trasfettati con carcinoma mammario. La linea cellulare quattro T uno mostra macchie bianche indicanti tumori. Topi trasfettati con un IRF otto dominante negativo immune al K 79 E mostrano il potenziale metastatico aumentato delle cellule tumorali.

Queste immagini mostrano un'analisi istologica dell'efficacia dell'immunoterapia mediante trasferimento adottivo di CTL. Topi con tumore inoculati con soluzione salina presentavano numerosi tumori sei giorni dopo, indicati dalle frecce. Al contrario, topi inoculati con linfociti T specifici per il tumore mostrarono una riduzione dei tumori nello stesso esperimento.

Il trattamento con inchiostro di India offre un metodo più semplice per misurare l'efficacia del trasferimento adottivo di CTL. In questo caso, le nodularità tumorali bianche sui polmoni affetti da tumore le distinguono chiaramente dai polmoni che hanno subito con successo il trasferimento adottivo di CTL, e il conteggio delle nodularità permette un grado di quantificazione non ottenibile con l'istologia. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di riscaldare i topi per facilitare iniezioni più accurate nella vena della coda.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare l'efficacia del trattamento mediante questa semplice procedura per quantificare dimensioni e numero dei tumori. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i tuoi esperimenti.